過濾完鹽酸萬古霉素后，微生物仍可正常生長---賽多利斯實(shí)驗(yàn)室

開展以下試驗(yàn)是用于證明Sterisart®系統(tǒng)在過濾完鹽酸萬古霉素后，仍可以讓微生物在其中正常生長。

試驗(yàn)背景

在沒有抑制劑的情況下，微生物可以快速增殖。可能存在于無菌檢測(cè)藥品樣品中的任何防腐劑或抗生素殘留物都必須在培養(yǎng)基加入系統(tǒng)之前被沖洗去除。由于萬古霉素不能被中和，所有與樣品接觸的部件必須為低吸附，且所采用的設(shè)計(jì)形式必須保證能夠?qū)崿F(xiàn)徹底沖洗從而去

除所有殘留。

試驗(yàn)描述

Sterisart® 系統(tǒng)經(jīng)無菌生理鹽水潤濕后，對(duì)鹽酸萬古霉素溶液進(jìn)行過濾。在完成沖洗步驟之后，根據(jù)歐洲藥典要求，將胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基加入Sterisart® 系統(tǒng)的一個(gè)容器內(nèi)。向這個(gè)容器內(nèi)接種50-100CFU微生物，進(jìn)行微生物培養(yǎng)，最多培養(yǎng)3天。取出另一個(gè)容器中的濾膜，進(jìn)行抑制試驗(yàn)。

材料和設(shè)備

抗生素鹽酸萬古霉素 

檢測(cè)菌株 

枯草芽孢桿菌 

金黃色葡萄球菌 

胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基Oxoid;

NaCl

Merck

泵

Sterisart®通用型無菌檢測(cè)泵，

Sterisart®通用型無菌檢測(cè)泵

Sterisart® 裝置

Sterisart® NF,

Sterisart® NF適配器

檢測(cè)準(zhǔn)備

v 無菌生理鹽水

為制備0.9%的無菌生理鹽水溶液，先將9g固體NaCl溶解于1L去離子水中，裝入帶有隔膜的瓶中，制備2L。然后對(duì)配制完成的溶液進(jìn)行121°C、40分鐘的高壓蒸汽滅菌。

2

抗生素溶液的溶解(20 g/L)

2.1  背景

抗生素的溶解是無菌檢測(cè)操作中非常關(guān)鍵的操作步驟。未溶解的殘留抗生素會(huì)被膜過濾器截留，導(dǎo)致培養(yǎng)過程中抑制微生物生長。試驗(yàn)表明使用30°C的生理鹽水溶解鹽酸萬古霉素最為迅速可靠。更為詳細(xì)的試驗(yàn)描述和試驗(yàn)結(jié)果請(qǐng)參考Sterisart® 應(yīng)用指南No.1。針對(duì)下一步驟，我們還專門開發(fā)了一種注入和搖勻的方法。生理鹽水的預(yù)熱可通過培養(yǎng)箱或水浴輕松實(shí)現(xiàn)

2.2  樣品制備

取事先準(zhǔn)備好一個(gè)帶有隔膜的500ml瓶(瓶A)， 內(nèi)含10g抗生素混合物。將Sterisart® NF適配器16470的無標(biāo)識(shí)管路插入泵中，然后將16470帶有黃色標(biāo)記的長針頭插入瓶B的隔膜中，該瓶內(nèi)裝有500ml已預(yù)熱至30°C的無菌生理鹽水；進(jìn)而將短針頭插入裝有抗生素的瓶A的隔膜中。瓶A以一定角度倒置，使

抗生素凍干粉落到瓶頸處。然后將NaCl溶液以設(shè)定值為300的泵速打入裝有抗生素的瓶A中。

大約5秒鐘后，將瓶A恢復(fù)正位，讓抗生素和NaCl溶液一起回落到瓶底。流體的泵入壓力要足以將粘在玻璃瓶壁上的抗生素沖洗下來。向瓶A注入溶液到500ml刻度，然后搖動(dòng)瓶子直至抗生素完全溶解。以上操作步驟使用了貨號(hào)為16470的Sterisart®NF適配器和貨號(hào)為16413的Sterisart®通用型無菌檢測(cè)泵，該泵是現(xiàn)有16420無菌檢測(cè)泵的上一代產(chǎn)品。有關(guān)Sterisart® NF 適配器16470使用的詳細(xì)信息見產(chǎn)品說明書。

試驗(yàn)方法

1

膜過濾

將Sterisart® 系統(tǒng)16466裝入泵中后，向系統(tǒng)泵入100ml無菌生理鹽水，用于潤濕濾膜。然后向Sterisart® 系統(tǒng)中泵入無菌空氣以排空溶液。隨后，500ml溶解好的抗生素經(jīng)容器濾過。需特別當(dāng)心，避免抗生素液體沾到后續(xù)無法沖洗到的區(qū)域。再次用無菌空氣排空裝置。隨后用5×200ml無菌生理鹽水沖洗濾膜，以確保無抗生素殘留在膜和塑料部件上，從而不會(huì)抑制微生物的生長。有關(guān)Sterisart®NF裝置的詳細(xì)使用信息見所附產(chǎn)品說明書。

2

注入培養(yǎng)基

將100ml大豆酪蛋白消化培養(yǎng)基注入Sterisart® 系統(tǒng)兩個(gè)容器中的一個(gè)。用夾子將管路夾緊封好，在距夾子約10cm處切斷管路。第二個(gè)容器用于進(jìn)一步檢測(cè)。(見 4.5).

3

接種微生物

鹽酸萬古霉素適用于多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌。因此試驗(yàn)使用枯草芽孢桿菌(革蘭氏陰性菌)。通過系列稀釋方式確保每ml枯草芽孢桿菌溶液中含50-100CFU菌。取1.0ml綠膿桿菌溶液加入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。

4

培養(yǎng)

Sterisart® 容器在30 °C條件下培養(yǎng)3天。每天檢查微生物的生長情況。

5

膜的抑制試驗(yàn)

Sterisart® 系統(tǒng)第二個(gè)容器中的Sartochem®

膜是用來進(jìn)行抑制試驗(yàn)的。打開裝置，移出膜，將膜分成以下3部分：

a: 中央膜片

b: 外部膜片

c: 支撐片

將三個(gè)膜組件分別放到接種有金黃色葡萄球菌的瓊脂平皿中，30°C培養(yǎng)24小時(shí)。一旦抗生素在膜的特定區(qū)域富集，這些區(qū)域的細(xì)菌生長就會(huì)受到抑制。

6

結(jié)果

培養(yǎng)24小時(shí)后，可觀察到輕微渾濁。培養(yǎng)3天后，Sterisart® 容器內(nèi)可明顯觀察

到細(xì)菌的生長。培養(yǎng)基非常渾濁（生長

情況良好）。抑制試驗(yàn)表明在膜的不同

區(qū)域均未有抗生素殘留。瓊脂平皿上的

微生物直接在膜邊緣生長。它們的生長

未受到抑制。

結(jié)論

使用5×200ml生理鹽水沖洗即可確保抗生素的有效去除。微生物生長試驗(yàn)結(jié)果表明測(cè)試所用鹽酸萬古霉素在Sterisart®系統(tǒng)內(nèi)沒有殘留，不存在促進(jìn)或抑制微生物生長效應(yīng)。