上個世紀初，科學家們認為蛋白質是生命體的遺傳物質，而具有獨特的作用。隨著這個理論被證偽，真正的遺傳物質DNA的結構被給予了很大關注。然而，蛋白質作為生命體的重要大分子，其重要性也從未被忽視，而且在1950年代開始，科學家一直在探尋DNA序列和蛋白質序列的相關性。與此同時，蛋白質測序和結構解析蛋白質結構的努力開始慢慢獲得回報。更多的生化研究揭示了蛋白質的功能重要性，因此蛋白質的三維結構的解析對于深入理解蛋白質功能和生理現象起著決定性作用。

　　蛋白質結構解析六十年來大事件

　　在1958年，英國科學家John Kendrew和Max Perutz首先發表了用X射線衍射得到的高分辨率的肌紅蛋白Myoglobin的三維結構，然后是更加復雜的血紅蛋白Hemoglobin。因此，這兩個科學家分享了1962年的諾貝爾化學獎。事實上，這項工作在早在1937年就開始了。

　　然后在1960年代，蛋白質結構解析方法不斷進步，獲得了更高的解析精度。這個時期，蛋白質序列和DNA序列間關系也被發現，中心法則被Francis Crick提出，然后科學界見證了分子生物學的崛起。分子生物學(Molecular Biology)的名稱在1962年開始被廣泛接受和使用，并逐漸演變出一些支派，如結構生物學。然后在1964年，Aaron Klug提出了一種基于X射線衍射原理發展而來的全新的方法電子晶體學顯微鏡(crystallographic electron microscopy )，可以解析更大蛋白質或者蛋白質核酸復合體結構。因為這項研究，他獲得了1982諾貝爾化學獎。1969年，Benno P. Schoenborn 提出可以用中子散射和原子核散射來確定大分子中固定位置的氫原子坐標。

　　進入1970年代，很多新的方法開始發展。存儲蛋白質三維結構的Protein Data Bank(1971年) 開始出現，這對于規范化和積累蛋白質數據有著重要意義。1975年新的一種儀器叫做多絲區域檢測器，讓X-ray的檢測和數據收集更加快速高效。次年，Robert Langride將X-ray衍射數據可視化，并在加州大學圣地亞哥分校成立了一個計算機圖形實驗室。同年，KeithHodgson和同事首次證明了可以使用同步加速器獲得的X射線并對單個晶體進行照射，并取得了很好的實驗效果。然后在1978年，核磁共振NMR首次被用于蛋白質結構的解析;同年首個高精度病毒(西紅柿叢矮病毒)衣殼蛋白結構被解析。

　　在1980年代，更多蛋白質結構被解析，蛋白質三維結構的描述越來越成熟，而且蛋白質結構解析也被公認成為藥物研發的關鍵步驟。在1983年，冷凍蝕刻的煙草花葉病毒結構在電子顯微鏡結構下得到描述。兩年后德國科學家John Deisenhofer等解析出了細菌光合反應中心，因此他們共享了1988年的諾貝爾化學獎。次年，兩個課題組解析了HIV與復制相關的蛋白酶結構，對針對HIV的藥物研發提供了理論基礎。

　　下一個十年，因為大量同步加速器輔助的X射線衍射的使用，數千個蛋白質結構得到解析，迎來了蛋白質結構組的曙光。1990年多波長反常散射方法(MAD)方法用于X射線衍射晶體成像，與同步輻射加速器一起，成為了近二十多年來的最常用的的方法。Rod MacKinnon在199年發表了第一個高精度的鉀離子通道蛋白結構，對加深神經科學的理解起了重要作用，因此他分享了2003年的諾貝爾化學獎。Ada Yonath等領導的課題組在1999年首次解析了核糖體結構(一種巨大的RNA蛋白質復合體)。

　　進入新千年，更多的技術細節被加入到蛋白質解析研究領域。2001年，Roger Kornberg和同事們描述了第一個高精度的RNA聚合酶三維結構，正因此五年后他們共享了諾貝爾化學獎。2007年，首個G蛋白偶聯受體結構的解析更是對藥物研究帶了新的希望。近些年來，越來越多的大的蛋白質結構得到解析。Cryo-EM超低溫電子顯微鏡成像用于超大蛋白質結構成像的研究日益成熟，并開始廣泛用于蛋白質結構的解析。

　　蛋白質結構解析的常用實驗方法

　　1.X-ray衍射晶體學成像

　　X射線衍射晶體學是最早用于結構解析的實驗方法之一。X射線是一種高能短波長的電磁波(本質上屬于光子束)，被德國科學家倫琴發現，故又被稱為倫琴射線。理論和實驗都證明了，當X射線打擊在分子晶體顆粒上的時候，X射線會發生衍射效應，通過探測器收集這些衍射信號，可以了解晶體中電子密度的分布，再據此析獲得粒子的位置信息。利用這種特點，布拉格父子研制出了X射線分光計并測定了一些鹽晶體的結構和金剛石結構。首個DNA結構的解析便是利用X射線衍射晶體學獲得的。

　　后來，獲得X射線來源的技術得到了改進，如今更多地使用同步輻射的X射線源。來自同步輻射的X射線源可以調節射線的波長和很高的亮度，結合多波長反常散射技術，可以獲得更高精度的晶體結構數據，也成為了當今主流的X射線晶體成像學方法。由X射線衍射晶體學解析的結構在RCSB Protein Data Bank中占到了88%。

　　X射線衍射成像雖然得到了長足的發展，仍然有著一定的缺點。X射線對晶體樣本有著很大的損傷，因此常用低溫液氮環境來保護生物大分子晶體，但是這種情況下的晶體周圍環境非常惡劣，可能會對晶體產生不良影響。而且，X射線衍射方法不能用來解析較大的蛋白質。

　　2.NMR核磁共振成像

　　核磁共振成像NMR全稱Nuclear magnetic resonance，最早在1938被Isidor Rabi (1946年諾貝爾獎)描述，在上世紀的后半葉得到了長足發展。其基本理論是，帶有孤對電子的原子核(自選量子數為1)在外界磁場影響下，會導致原子核的能級發生塞曼分裂，吸收并釋放電磁輻射，即產生共振頻譜。這種共振電磁輻射的頻率與所處磁場強度成一定比例。利用這種特性，通過分析特定原子釋放的電磁輻射結合外加磁場分別，可以用于生物大分子的成像或者其他領域的成像。有些時候，NMR也可以結合其他的實驗方法，比如液相色譜或者質譜等。

　　RCSB Protein Data Bank數據庫中存在大約11000個用NMR解析的生物大分子結構，占到總數大約10%的結構。NMR結構解析多是在溶液狀態下的蛋白質結構，一般認為比起晶體結構能夠描述生物大分子在細胞內真實結構。而且，NMR結構解析能夠獲得氫原子的結構位置。然而，NMR也并非萬能，有時候也會因為蛋白質在溶液中結構不穩定能難得獲取穩定的信號，因此，往往借助計算機建模或者其他方法完善結構解析流程。

　　使用NMR解析的血紅蛋白結構建模(圖片來源RCSB PDB)

　　3.Cryo-EM超低溫電子顯微鏡成像

　　電子顯微鏡最早出現在1931年，從設計之初就是為了試圖獲得高分辨率的病毒圖像。通過電子束打擊樣本獲得電子的反射而獲取樣本的圖像。而圖像的分辨率與電子束的速度和入射角度相關。通過加速的電子束照射特殊處理過的樣品表明，電子束反射，并被探測器接收，并成像從而獲得圖像信息。具體做法是，將樣品迅速至于超低溫(液氮環境)下并固定在很薄的乙烷(或者水中)，并置于樣品池，在電子顯微鏡下成像。圖像獲得后，通過分析圖像中數量眾多的同一種蛋白質在不同角度的形狀，進行多次的計算機建模從而可以獲得近原子級別的精度(最低可以到2.0埃)。

　　Cyro-EM解析TRPV1離子通道蛋白(圖片來源Structure of the TRPV1 ion channel )

　　將電子顯微鏡和計算機建模成像結合在一起的大量實踐還是在新世紀之后開始流行的。隨著捕捉電子的探測器技術(CCD技術，以及后來的高精度電子捕捉、電子計數electron counting設備)的提升，更多的信息和更低的噪音保證了高分辨率的圖像。

　　近些年來，Cryo-EM被用來解析很多結構非常大(無法用X-ray解析)的蛋白質(或者蛋白質復合體)，取得了非常好的結果。同時，單電子捕捉技術取代之前的光電轉換成像的CCD攝像設備，減少了圖像中的噪音和信號衰減，同時并增強了信號。計算機成像技術的成熟和進步，也賦予了Cryo-EM更多的進步空間。然而，Cyro-EM與X-ray不同，該方法不需要蛋白質成為晶體，相同的是都需要低溫環境來減少粒子束對樣品的損害。

　　除去介紹的這三種方法以外，計算機建模技術也越來越多地被用在了蛋白質結構解析中。而且新解析的結構也會提高計算機建模的精確度。未來，我們或許能夠用計算機構建原子級別的細胞模型，構建在芯片上的細胞。

　　蛋白質結構對了解生命體的生化反應、有針對性的藥物研發有著重要意義。從1958到如今已經接近60年，蛋白質結構解析得到了較快的發展。然而，在如今DNA測序如此高效廉價的時代，蛋白質和DNA結構解析并沒有進入真正高速發展階段，這也導致了在如此多的DNA序列數據非常的今天，結構數據卻相對少的可憐。大數據時代的基因組、蛋白質組、代謝組、脂類組等飛速發展的時候，蛋白質結構組也得到了更加廣泛的重視。發展高精度、高效的結構解析技術也一直都有著重要意義。未來，蛋白質結構解析，對針對蛋白質的藥物篩選，和計算機輔助的藥物研究研究不應被低估。未來說不定在蛋白質結構領域有著更多驚喜，我們拭目以待。