近日，Biotechniques網站介紹了2014年在該網站發表的5篇最有趣和最有用的PCR方法相官的論文。從這些論文我們可以發現研究人員仍在繼續改善PCR的各個方面，從基本的擴增策略到最新技術，如數字PCR。我們希望這一令人鼓舞的趨勢在來年將會繼續。

　　PCR 是現代分子生物學中的一種基本技術，所以它的任何創新或改進都受到研究人員的極大歡迎。BioTechniques的編輯們一直都非常喜歡PCR方法，我們很高興看到，2014年帶來了新技術的強大選擇。在這里，我們介紹了在過去一年中發表的5篇PCR方法相關論文，范圍很廣，從基本老式PCR反應有效性和特異性的改進，到尖端技術如數字PCR。

　　1、一種強大的耐熱DNA聚合酶鏈置換活性可顯著改善DNA擴增結果

　　誰不喜歡一種多功能的工具呢?當你可以用有些奇怪但很方便、孩子喜歡的叉勺時，為什么還去用勺子和叉子呢?在8月刊的 BioTechniques，Ignatov等人描述了DNA聚合酶的叉勺等價物，一種可用于常規PCR反應以及等溫擴增的DNA聚合酶。直到現在，這兩種擴增方法還需要非常不同類型的DNA聚合酶：對于PCR來說，一種耐熱DNA聚合酶(如Taq酶)，可以經受住每一個PCR循環中的熱變性步驟;對于等溫擴增來說，一種DNA聚合酶如Bst，具有很強的鏈置換活性，使DNA鏈分開而代替熱變性。Ignatov和同事們證明，一種新型TaqDNA聚合酶突變體，具有很強的鏈置換活性，稱為SDDNA聚合酶，不僅可用于PCR和環介導等溫擴增法(LAMP)以及最近描述的聚合酶鏈置換反應方法，而且能夠改善靈敏度和效率，即使在困難的情況下，例如長片段PCR或GC富集模板的擴增。這種多用途的新型DNA聚合酶應該是對DNA擴增酶工具箱的一種受歡迎的補充。[文獻]

　　2、牛凝血酶可提高聚合酶鏈式反應的效率和特異性

　　當PCR不能正常工作，或產生非特異性擴增產物和引物二聚體而不是預期的擴增子時，這是非常令人沮喪的。多年來，研究人員已經在PCR反應中添加了許多化合物，以提高DNA擴增的特異性和效率。這些添加物范圍很廣，從小的有機分子(例如甘油和甜菜堿)到非離子型洗滌劑(如TritonX-100和Tween，到蛋白質如BSA)。不幸的是，每一種添加物只在一組特定的條件下改善PCR擴增結果。真正理想的狀態是，一種PCR增強劑在盡可能多的不同情況下都可以起作用，XinhuiLou 及其同事偶然發現了牛凝血酶(BT)。他們在12月份發表的論文中描述道，BT在低于BSA20到180倍的濃度，能改善范圍廣泛的模板DNA的PCR特異性和效率，同時還能夠緩解納米材料(如氧化石墨烯和金納米粒子)引起的抑制作用。[文獻]

　　3、在PCR之前線性擴增模板可改善低模板DNA的結果

　　一種重要的PCR擴增是，擴增少量的源DNA，為法醫或古DNA研究提供足夠的材料。然而，一個主要的問題是，提供足夠多的DNA，往往必須擴大PCR循環的次數，以用于基因型分型應用，這會引起隨機抽樣效應，導致等位基因或位點脫離或雜合等位基因丟失，從而使基因型分型很難或者不可能。作為一種解決方案，KellyGriesdale和Angelavan Daal假設，在PCR擴增之前，與單獨PCR擴增相比，少量目標DNA的線性擴增用于基因型分型，將會以一種更具代表性的方式，增加模板的數量。使用這種方法，他們能夠證明，與不用pre-PCR線性擴增步驟的樣品相比，從越來越少的人類基因組DNA的多重STR基因型分型重新獲得的等位基因總數顯著提高。[文獻]

　　4、利用QIAshredder而不是限制性內切酶為液滴數字PCR準備DNA的優點

　　作為PCR的最新版本，數字PCR已經成為定量分析高準確度靶序列的一種日益流行的方法。該技術的一個重要方面在于，在PCR之前，DNA樣本在大量分區之間的平均分布，無論是在微流控well還是在微油滴。然而，當使用大量基因組DNA時，高粘度可以影響平均分區。在這些情況下，制造商通常建議在分區步驟之前限制性消化DNA樣本。然而，這樣的反應可能是費時耗力的步驟，更不用說限制性緩沖液還會負面地影響后續的PCR。在4月份發表的一篇論文中個，Yukl等人表明，QIAshredder——含有一種生物聚合物(可降低粘度，據報道可剪切DNA)的微型離心機旋轉柱，可以代替限制性消化使用，來為液滴數字PCR(ddPCR)準備基因組DNA，從而在很寬范圍的輸入DNA數量測出更大的拷貝數。因為它節省時間和勞動力，所以當為ddPCR準備大量基因組DNA時，QIAshredder可以被看作是限制性消化的一種不錯的替代法。[文獻]

　　5、在單一液滴數字PCR反應中同時定量可變剪接轉錄本

　　數字PCR的一個應用就是，定量來自于一個基因的可變剪接mRNA的相對數量。Yun-LingZheng及其同事們感興趣的是，檢測人端粒逆轉錄酶(hTERT)基因產生的20個左右的剪接變體中的4個特定剪接變體。這四個轉錄本不同之處在于，它們是否包括α外顯子和/或β外顯子，因為它們出現在許多類型的腫瘤中，因此是潛在的癌癥生物標志物。他們擔心，以前測定這4種剪接變體(α–/β ;α /β–;α–/β–;α /β )的qPCR試驗不夠敏感，因為它們的表達水平較低，作者決定轉而使用液滴數字PCR(ddPCR)。在6月刊發表的論文中，他們設計了一種方法，在一個單一的ddPCR反應中同時測定α和β外顯子的有無，而不是用標準方法，為每個樣本設置兩次ddPCR反應，以測定每個外顯子。只使用一對PCR引物和兩種不同的雙標記熒光水解探針，Zheng的研究小組能夠在每個樣本的單次反應中比較四種剪接異構體的水平。