蛋白質的分離純化有多類方法，如沉淀法（特別常用鹽析法、等電點沉淀法、有機溶劑沉淀法）、膜分離法（超濾法、透析法）、色譜法、離心分離法等。每類方法有其自己的特點和適用范圍。如粗提常用沉淀法，精提就不會用沉淀法。這些方法中，應用最廣的是色譜法。

　　色譜法，在生化和醫藥行業叫層析。但中國化學會、中科院相關部門及有關期刊都規定要叫色譜。在國家有關色譜名詞術語的國家標準中“chromatography”一詞翻譯成“色譜”。故在此我們將柱分離叫色譜。柱內的分離介質一般也叫填料、固定相。

　　在蛋白質色譜純化中最重要的是分離介質和色譜條件的選擇。有些從事分離工作的人，拿到樣品后常不知道怎么辦。其實這兩者的選擇只要根據分離對象和每種色譜的分離機理來考慮，就可以自行設計分離方案。蛋白質分離介質的選擇應從蛋白質分子結構入手考慮。與一般小分子的天然產物和合成化合物的分離純化工作比起來，蛋白質的分離有許多特殊性。

　　1.蛋白質分子的結構決定了其分離工作的方法選擇。

　　蛋白質分子量大，都在6KD以上，是由多個氨基酸按一定序列通過肽鍵組合成肽鏈，再由一個或多個肽鏈通過共價鍵和非共價鍵組合成有復雜三級、四級結構的蛋白質分子。蛋白質還可能與糖、脂及核酸結合得到結合蛋白，不同的結合蛋白在性質上會有差異。蛋白質的外形為球狀和纖維狀，其大小因其分子量不同差異很大。故可以用排阻色譜、超濾和膜法分離大小不同的蛋白質。

　　蛋白質與氨基酸一樣，會兩性離解，在不同的pH下形成正離子或負離子，蛋白質也有等電點。在相同的pH下，不同的蛋白質表面帶電情況不一樣，故可以用離子交換色譜分離蛋白質。

　　蛋白質的氨基酸殘基會有一些苯基、烷基等疏水性基團，這些疏水側鏈在水相中會盡可能避開水相而藏于蛋白質分子內部，形成蛋白質分子外部親水性基團多，疏水性基團多在蛋白質裂隙內部的情況，在不同條件下蛋白質裂隙會有不同的伸展而暴露出內部的疏水基團。在同一個介質中，不同蛋白質表面的疏水性不同，可以用疏水相互作用色譜和反相色譜分離。

　　生物大分子有一個特性，某些分子或基團對它們有特異性很強的吸附作用。這種作用只針對一種或一類目標物質。如抗體特異性吸附抗原，苯甲脒對含絲氨酸的蛋白質有吸附作用。這就是親和色譜的應用原理, 一般的小分子是不會有這種特異性吸附作用的。

　　2.要特別注意保持樣品的生物活性。

　　蛋白質有復雜的三級、四級結構，熱、光和化學品會導致其理化性質改變和生理活性喪失，這叫失活。失活有可逆和不可逆兩種。不可逆失活的蛋白質常是固體，不溶于水和溶劑，不再具有蛋白質原有的生理性質。可逆失活的蛋白質可用不同的復性方法恢復其原有的生理活性。

　　蛋白質在選擇和評價分離純化的方法、介質和色譜條件時，不僅要注意樣品的質量回收率，還特別要重視活性回收率。要保持樣品的生物活性，在分離方法、填料、色譜條件和操作工藝上要注意。

　　在排阻、離子交換、疏水和反相、親和四類色譜中，反相色譜一般容易使樣品失活，常用于定性、定量分析和氨基酸序列分析，不太用于制備；其他的色譜方法，只要條件選擇合適，都可以得到高的活性回收率。

　　3.使用的色譜介質要注意其合適的分子量適用范圍。

　　一般的介質都是多孔的，多孔介質的比表面有90%~95% 是在孔內。分離時充分利用孔內表面，柱容量才能大。所以要根據樣品分子量選擇具有合適的孔的介質。在排阻色譜中孔的大小用排阻極限表示；其他色譜用分子量適用范圍表示，實際是其基質的排阻極限。

　　常用的蛋白質分離介質是瓊脂糖和葡聚糖系列。瓊脂糖的分子量適用范圍取決于制備時瓊脂糖的濃度，大家熟悉的4B，糖的濃度是4%，適用6×10 4~2×10 7分子量；6B，糖的濃度是6%，適用1×10 4~4×10 6分子量。葡聚糖系列的分離范圍要看產品說明書，從幾千到上千萬不等。

　　常用的硅膠系列孔徑有用于小分子的6~12nm ；有用于一定分子量蛋白質的30 、 50、100nm。

　　4. 生物大分子有不同于小分子的色譜特性。

　　包括蛋白質在內的生物大分子有一些特別的色譜性質。

　　在梯度洗脫的色譜，如反相色譜、疏水色譜、離子交換中，強洗脫劑的濃度對保留值（容量因子）作圖有明顯的突躍。而有機小分子沒有此突躍。在蛋白質分離的許多問題可由此得到解釋。

　　5.紫外檢測器檢測波長固定在280nm和220nm 。

　　280nm是檢測蛋白質中的苯基，220nm是檢測肽鍵。蛋白質檢測實際常在選用280nm 檢測波長。

　　蛋白質分離介質選擇要同時考慮兩方面，一是配基，也就是選擇色譜模式；二是選擇基質，包括基質的種類和排阻極限的選擇。

　　根據目標產品與雜質的性質差異選擇介質是介質選擇的主要依據。選擇了介質也就是選擇了分離模式。

　　目標產品與雜質在分子大小、等電點pI、不失活或可逆失活條件下的疏水性、與親和配基的作用四種性質上的差異是介質選擇的主要依據之一。產品與雜質某方面的性質有大的差異，就可用來做為分離方法選擇的依據。目標產品與雜質分子大小差異大可用凝膠色譜分離；等電點pI差異大可用離子交換色譜分離；不失活或可逆失活條件下的疏水性差異大可用疏水色譜分離；與某個親和配基有特異作用的可用親和色譜分離。

　　在凝膠色譜、離子交換、疏水和反相、親和類色譜中，反相色譜一般容易使樣品失活，常用于定性、定量分析和氨基酸序列分析，不太用于制備；其他的色譜方法，只要條件選擇合適，都可以得到高的活性回收率，可以用于制備分離。

　　基質主要有3大類：聚多糖，如交聯瓊脂糖、葡聚糖基質；硅膠和多孔玻璃；有機聚合物（聚苯乙烯等）。

　　由于目標產品限定在蛋白質，分子量比較大，用于小分子的小孔填料肯定不能用。因為，多孔填料的總的表面積，有90~95%是在孔內，球型填料的球面上的面積只占有5~10%。小孔填料的柱容量太小。

　　大孔硅膠和多孔玻璃，與蛋白質生物相容性差，大孔硅膠價格貴，表面活性基團少，制備的填料會殘留酸性的硅羥基，造成非特異性吸附。大孔有機聚合物疏水性強，與蛋白質生物相容性太差，不作親水性處理無法用于蛋白質分離。

　　交聯瓊脂糖、葡聚糖基質是最適合用于蛋白質分離的基質材料，這兩類材料生物相容性好，無非特異性吸附，表面有大量羥基，可用于連接配基，制得各種填料。

　　瓊脂糖微球及其交聯后的產品一般叫4B、CL4B、4FF、6B、CL6B、6FF，這些產品再鍵合上不同基團得到離子交換、疏水、親和色譜填料。4B、CL4B、4FF制備時的糖濃度為4%，排阻極限為6萬~2000萬。6B、CL6B、6FF制備時的糖濃度為6% ，排阻極限為1萬 ~400萬。4B、6B耐壓低；CL4B、CL6B耐壓稍高一點，仍很低；4FF、6FF耐壓較高，使用壓力可到0.15或0.3MPa。

　　葡聚糖是線形結構，用環氧氯丙烷交聯成球。因糖濃度和交聯度不同，得到不同排阻極限的微球。葡聚糖微球排阻極限范圍小些，在使用時不同條件下柱體積會有較大的變化，已逐漸較少用于離子交換、疏水、親和色譜，較多用于凝膠色譜。