尿調(diào)蛋白（uromodulin）又稱為Tamm-Horsfall蛋白，最早于1950年由Tamm和Horsfall于尿中發(fā)現(xiàn)，是尿液中含量最豐富的蛋白質(zhì)，由腎小管髓袢升支粗段的上皮細胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成，經(jīng)過高爾基體的加工，分泌到腎小管上皮細胞管腔面的細胞膜上，部分進入尿液，成為構(gòu)成管型的重要成分。既往的研究證實尿調(diào)蛋白與腎結(jié)石和泌尿系感染有關(guān)，近幾年研究提示尿調(diào)蛋白在慢性腎病中可能發(fā)揮重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，尿尿調(diào)蛋白的水平與人群中慢性腎病的發(fā)生密切相關(guān)，可能有助于IgA腎病的診斷，因此，建立實用、可靠的檢測尿尿調(diào)蛋白的方法非常迫切。文獻報道的檢測方法操作繁瑣、所需時間長、有放射性污染，對于大樣本人群檢測受到限制。本研究建立了針對尿調(diào)蛋白的簡便、快速的酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA）測定方法，同時對IgA腎病患者進行了尿尿調(diào)蛋白的檢測，探討IgA腎病中尿尿調(diào)蛋白含量的變化。  

　　1資料與方法
　　1.1材料  
　　正常人尿樣：取腎功能正常、尿常規(guī)檢查陰性的正常人所留取的尿液標本，共48例，男27例，女21例，平均年齡（32.8±1.3）歲，估計腎小球濾過率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）為(102.3±3.69) mL/min/1.73 m2，留清晨第1次尿液，離心后-80 ℃保存。 
　　IgA腎病患者：選擇北京大學第一醫(yī)院腎內(nèi)科經(jīng)腎穿刺確診為IgA腎病的住院患者166例，除外合并妊娠、泌尿系感染、糖尿病、腫瘤、肝硬化、過敏性紫癜、痛風和腎結(jié)石的患者。患者的年齡(31.5±0.9)歲，男84例，女82例，eGFR為(101.83±1.04) mL/min/1.73 m2。于腎穿刺當日留取清晨第1次尿液，離心后-80 ℃保存。 

　　1.2試劑：本研究應(yīng)用的主要試劑有兔抗人尿調(diào)蛋白多克隆抗體，小鼠抗人尿調(diào)蛋白單克隆抗體，辣根酶標記山羊抗小鼠IgG，牛血清白蛋白，尿調(diào)蛋白校準品，尿調(diào)蛋白檢測試劑盒

　　1.3免疫組織化學染色：取腎腫瘤切除手術(shù)時留取的正常腎組織，經(jīng)石蠟固定后切片，厚4m，進行常規(guī)免疫組織化學染色，分別以兔抗人尿調(diào)蛋白多克隆抗體和小鼠抗人尿調(diào)蛋白單克隆抗體作為一抗。

　　1.4ELISA方法的建立 
　　多抗包被：用0.1 mol/mL pH 9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋兔抗人尿調(diào)蛋白多克隆抗體，酶標板100 ?L/孔，37 ℃孵育1 h，0.1%（體積分數(shù)）Tween-0.01 mol/L pH 7.4 的PBS液(即PBST)洗3次，置于-80℃?zhèn)溆谩?nbsp;
　　封閉：3%牛血清白蛋白（BSA，0.05 mol/L PBS稀釋）室溫封閉1 h，PBST洗3次。 
　　加樣：Uromodulin標準品從12.5ng/ml開始對比稀釋，尿液標本以TEA（0.5% Triton X-100 和20mMEDTA, pH 7.5,）1:200─4000稀釋，100ul/孔,37℃孵育2小時， PBST洗3次； 
　　檢測抗體：小鼠抗人尿調(diào)蛋白單克隆抗體用PBST稀釋，100ul/孔37℃孵育1小時，PBST洗3次； 
　　酶標抗體：辣根酶標記山羊抗小鼠IgG 1: 5000稀釋，100ul/孔37℃孵育0.5小時，PBST洗3次； 
　　顯色：TMB顯色，酶聯(lián)檢測儀上讀數(shù)。 
　　數(shù)據(jù)處理：以uromodulin校準品濃度繪制標準曲線，當r值在0.99以上方可使用。 
　　批內(nèi)精密度：相同標本同時檢測20次，其值的變化算出實驗內(nèi)的變異系數(shù)。 批間精密度：不同日期、相同標本測出的uromodulin數(shù)值之間的變異系數(shù)。

　　1.5尿肌酐檢測方法：相關(guān)標本尿肌酐檢測采用堿性苦味酸法，用全自動生化分析儀進行檢測

　　1.6  統(tǒng)計學分析：所有數(shù)據(jù)均經(jīng)正態(tài)分布檢驗，描述性數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤表示。尿調(diào)蛋白商品化試劑盒檢測結(jié)果與本方法檢測比較采用配對t檢驗相關(guān)分析，尿尿調(diào)蛋白和IgA腎病的相關(guān)性采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

　　2結(jié)果 
　　2.1抗體結(jié)合特異：使用尿調(diào)蛋白單克隆抗體和多克隆抗體進行腎組織的免疫組化染色，可看到尿調(diào)蛋白特異地表達在部分腎小管上皮細胞，尿調(diào)蛋白特異地分布在腎小管髓袢及遠曲小管。

　　2.2標準曲線：經(jīng)方陣滴定，得到的最適條件為：多克隆抗體1:4 000以0.1 mol/mL pH 9.6碳酸鹽緩沖液稀釋、包板；單克隆抗體1:500以PBST稀釋；校準品及尿液標本以TEA（即0.5% Triton X-100和20 mmol/L EDTA, pH 7.5）稀釋，校準品曲線范圍為0.78~12.5 ?g/L。 

　　2.3精確性與重復性 20份樣本的批內(nèi)精密度為7.5%，5份樣本（其值分別為3.5、11.8、23.6、33.4、39.3 mg/L）測定3次的批間精密度為7.9%。

　　2.4商品化試劑盒與本實驗方法結(jié)果比對：55例不同濃度的標本商品化試劑盒和本研究所建立的試驗方法同時檢測，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)相關(guān)系數(shù)為r=0.615，P<0.001。

　　2.5IgA腎病患者尿尿調(diào)蛋白/尿肌酐的相關(guān)性：采用尿尿調(diào)蛋白/尿肌酐代表尿調(diào)蛋白的腎臟排泄。ANOVA分析發(fā)現(xiàn)，IgA腎病患者的尿尿調(diào)蛋白/尿肌酐比值為(3.52±0.59) mg/g (n=166)，明顯低于正常人[(18.39±3.46) mg/g, n=48, P<0.001]。 

　　3討論：建立本實驗方法的關(guān)鍵是要有與uromodulin特異性結(jié)合的抗體。在正常腎組織上進行免疫組織化學試驗顯示，陽性部位均表達于腎小管上皮細胞腔膜面，可以證實兩種抗體均為高特異性抗uromodulin抗體，符合實驗要求。 
　　經(jīng)過多次對試驗結(jié)果驗證，實驗的最適條件為：多克隆抗體以1:4 000包板，單克隆抗體以1:500作為檢測抗體，標準曲線相關(guān)性可以達到0.99以上，最低檢出限為0.1 mg/L，完全可以滿足科研工作的要求。20份標本的室內(nèi)變異系數(shù)為7.5%，表明實驗的準確性是令人滿意的。盡管ELISA的影響因素很多，但是相同樣本在不同日期的3次檢測結(jié)果變異系數(shù)為7.9%，小于15%，說明本方法穩(wěn)定，檢測結(jié)果重復性好。 
　　與商品化試劑盒相比，相同標本在不同檢測體系所得結(jié)果具有高度相關(guān)性，證實本實驗所建立的方法可以應(yīng)用于尿液中uromodulin的檢測。