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水平式瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA

[2015/11/16]

  實驗原理閉合環狀質粒、線性質粒和開環質粒DNA由于構形不同,在加溴化乙錠的瓊脂糖凝膠電泳上呈現不同的遷移率,因而在紫外燈下觀察,能區別閉合環狀質粒DNAcccDNA)、線性質粒DNAL-DNA)和開環質粒DNAocDNA)。

  實驗步驟
  1.選擇合適的水平式電泳槽,調節電泳槽平面至水平。檢查穩壓電源與正負極的線路。
  2.選擇孔徑大小合適的點樣梳子,垂直架在電泳膠模的一端,使點樣梳子底部離電泳膠模底部的距離為1.0 mm
  3.制備0.7%瓊脂糖凝膠,100℃水浴加熱至瓊脂糖融化均勻。
  4.用吸管取少量瓊脂糖凝膠溶液將電泳膠模四周密封好,防止澆灌瓊脂糖凝膠板時發生滲透。待瓊脂糖凝膠冷卻至60℃左右時,加入一滴溴化乙錠,搖勻,輕輕倒入電泳膠模中,瓊脂糖凝膠的厚度在3~5 mm。倒膠時要避免產生氣泡,若有氣泡可用吸管小心吸去。
  5.瓊脂糖凝膠凝固后,在室溫放置20分鐘,小心拔掉點樣梳子和電泳膠模兩端的擋板,保持點樣孔的完好。
  6.將電泳膠模放入電泳槽中,加入電泳緩沖液,使電泳緩沖液面高出瓊脂糖凝膠表面1~2 mm。如點樣孔內有氣泡,用吸管小心吸出,以免影響加樣。
  7.15mlDNA樣品與1/5體積的溴酚藍指示劑點樣緩沖液混合。上樣緩沖液不僅可以提高樣品的密度,使樣品均勻沉到樣品孔內,還可以使樣品帶顏色,便于上樣和估計電泳時間和判斷電泳的位置。
  8.用微量移液器將樣品小心加入加樣孔內,記錄樣品點樣秩序。
  9.蓋上電泳槽,開啟電源開關,最高電壓不超過5 V/cm100~150 V恒壓電泳),使DNA從負極向正極移動。
  10.電泳時間隨實驗的具體要求而異。電泳一般需1~3小時。電泳完畢后關閉電源,戴一次性塑料手套取出凝膠,盡可能將所有的電泳緩沖液淋干,在254 nm 波長的透射紫外燈下觀察。

  提示
  一、瓊脂糖凝膠電泳
  1.瓊脂糖凝膠的性質瓊脂糖是從海藻中提取的一種直鏈多糖,它由D-半乳糖和3,6-脫水-L-半乳糖的殘基交替排列組成的線型多聚糖。當瓊脂糖加熱至90100℃左右,即可形成清亮透明的液體。澆在模板上冷卻至4045℃時,凝固形成凝膠。瓊脂糖帶有親水性,不含有帶電荷的基團,不引起DNA變性,又不吸附被分離的物質,因此它是一種很好的凝膠劑。瓊脂糖凝膠可區分相差100bpDNA片段。
  2.DNA分子的遷移率DNA分子在電泳中的遷移率的因素是多方面的,除了決定于DNA分子大小與構型外,還有瓊脂糖凝膠的濃度、電壓大小、緩沖液pH值和電泳時的溫度等。

  二、實驗操作中注意的問題
  1.加熱溶解瓊脂糖時應不斷地搖動容器,使附于壁上的顆粒也完全溶解。
  2.溴化乙錠是一種強致癌劑,并有中度毒性,因此必須十分謹慎小心。操作時一定要戴手套,用過的手套要及時將手套順手翻過來,讓污染有溴化乙錠的面朝里。
  3.254 nm 波長的紫外光進行觀察的效果比366nm清晰,但產生的切口DNA量也較高。紫外光對眼睛有害,觀察時應戴上眼鏡或防護面罩。


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