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PCR操作步驟及注意

[2015/1/15]

　　PCR能快速特異擴增任何已知目的基因或DNA片段，并能輕易在皮克(pg)水平起始DNA混合物中的目的基因擴增達到納克、微克、毫克級的特異性DNA片段。因此，PCR技術一經問世就被迅速而廣泛地用于分子生物學的各個領域。它不僅可以用于基因的分離、克隆和核苷酸序列分析，還可以用于突變體和重組體的構建，基因表達調控的研究，基因多態性的分析，遺傳病和傳染病的診斷，腫瘤機制的探索，法醫鑒定等諸多方面。
　　PCR操作步驟:
　　1.在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。 10×PCR buffer 5 μl dNTP mix (2mM) 4 μl 引物1(10pM) 2 μl 引物2(10pM) 2 μl Taq酶 (2U/μl) 1 μl DNA模板(50ng-1μg/μl) 1 μl 加ddH2O至 50 μl 視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
　　2. 調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進入循環擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環30-35次，最后在72℃ 保溫7min。
　　3. 結束反應，PCR產物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
　　4.PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μl氯仿進行抽提反應混合液，以除去石蠟油;否則，直接取5-10μl電泳檢測。
　　PCR注意事項:
　　1.PCR反應應該在一個沒有DNA污染的干凈環境中進行。最好設立一個專用的PCR實驗室。
　　2.純化模板所選用的方法對污染的風險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡單越好。
　　3.所有試劑都應該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應戴手套。
　　4.PCR試劑配制應使用最高質量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
　　5.試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續性。
　　6.試劑或樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。
　　7.PCR的樣品應在冰浴上化開，并且要充分混勻。
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