1. 取出細(xì)胞爬片，迅速置入冷丙酮固定 20~30 分鐘

　　2. 蒸餾水浸泡 5 分鐘，2 次。

　　3. 打孔液浸泡 5 分鐘。

　　4. 蒸餾水浸泡 5 分鐘，2 次。

　　注：第 3、4 步僅用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗原，檢測(cè)細(xì)胞膜抗原時(shí)不用。

　　5. 正常血清封閉：從染片缸中取出切片，擦凈切片背面水分及切片正面組織周圍的水分 (保持組織呈濕潤(rùn)狀態(tài),)滴加正常山羊或兔血清 (與第二抗 體 同源動(dòng)物血清)處理，37℃，15 分鐘。

　　附：正常血清配制 ( 或按試劑盒規(guī)定的濃度配制)：按 1:20比例，用 PBS 配制，每張切片需要量按 50μ+5μl (10%拋灑量) 計(jì)算。

　　6. 滴加第一抗體：用濾紙吸去血清，不洗，直接滴加第一抗體，37℃ 2 小時(shí)(也可置于 4℃冰箱過夜) 。

　　7. PBS：5 分鐘，2 次(置于搖床) 。

　　8. 滴加生物素化的二抗，37℃，40 分鐘。

　　9. PBS：5 分鐘，2 次(置于搖床) 。

　　10. 滴加三抗 (SAB 復(fù)合物) ，37℃，40 分鐘。

　　11. PBS：5 分鐘，2 次(置于搖床) 。

　　12. DAB 顯色，鏡下觀察，適時(shí)終止(自來(lái)水沖終止) 。

　　附：DAB 的配制① 儲(chǔ)備液(DAB 25mg/ml)的配制：DAB 250mg + PBS 10ml，待完全溶解后分裝成 1ml，100μl，50μl ，20μl 等，-20℃，凍存。② 工作液：DAB 儲(chǔ)備液 20μl + PBS 1000μl + 3% H2O2 5μl

　　13. 自來(lái)水(細(xì)水)充分沖洗。

　　14. 蘇木素復(fù)染，室溫，30 秒，自來(lái)水沖洗。

　　15. 自來(lái)水沖洗返藍(lán)，15 分鐘。

　　16. 梯度酒精脫水：80%，2 分鐘 95%，2 分鐘 100%，2 次，5 分鐘。

　　17. 二甲苯透明：I ，II (二甲苯)各 5 分鐘

　　18. 封片：加拿大樹膠(或中性樹膠)封片。