三、Folin—酚試劑法(Lowry法)

　　(一)實驗原理

　　這種蛋白質測定法是最靈敏的方法之一。過去此法是應用最廣泛的一種方法，由于其試劑乙的配制較為困難(現在已可以訂購)，近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即Folin—酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質的靈敏度。這兩種顯色反應產生深蘭色的原因是：?在堿性條件下，蛋白質中的肽鍵與銅結合生成復合物。?Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產生深蘭色(鉬蘭和鎢蘭的混合物)。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。

　　Folin—酚試劑法最早由Lowry確定了蛋白質濃度測定的基本步驟。以后在生物化學領域得到廣泛的應用。這個測定法的優點是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，缺點是費時間較長，要精確控制操作時間，標準曲線也不是嚴格的直線形式，且專一性較差，干擾物質較多。對雙縮脲反應發生干擾的離子，同樣容易干擾Lowry反應。而且對后者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素(0.5%)，硫酸納(1%)，硝酸納(1%)，三錄乙酸(0.5%)，乙醇(5%)，乙迷(5%)，丙酮(0.5%)等溶液對顯色無影響，但這些物質濃度高時，必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉—氫氧化鈉溶液，即可顯色測定。若樣品酸度較高，顯色后會色淺，則必須提高碳酸鈉—氫氧化鈉溶液的濃度1~2倍。

　　進行測定時，加F olin—酚試劑時要特別小心，因為該試劑僅在酸性pH條件下穩定，但上述還原反應只在pH=10的情況下發生，故當Folin一酚試劑加到堿性的銅—蛋白質溶液中時，必須立即混勻，以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑 被破壞之前，還原反應即能發生。

　　此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。

　　此法可檢測的最低蛋白質量達5mg。通常測定范圍是20~250mg。

　　(二)試劑與器材

　　1.試劑

　　(1)試劑甲：

　　(A) 10克 Na2CO3，2克 NaOH和0.25克酒石酸鉀鈉 (KNaC4H4O6·4H2O)。溶解于500毫升蒸餾水中。

　　(B) 0.5克硫酸銅(CuSO4·5H2O)溶解于100毫升蒸餾水中，每次使用前，將50份(A)與1份(B)混合，即為試劑甲。

　　(2)試劑乙：

　　在2升磨口回流瓶中，加入100克鎢酸鈉(Na2WO4·2H2O),25克鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)及700毫升蒸餾水，再加50毫升85%磷酸，100毫升濃鹽酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小時，回流結束時，加入150克 硫 酸 鋰(Li2SO4)，50毫升蒸餾水及數滴液體溴，開口繼續沸騰15分鐘，以便驅除過量的溴。冷卻后溶液呈黃色(如仍呈綠色，須再重復滴加液體溴的步驟)。稀釋至1升，過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。使用時用標準NaOH滴定，酚酞作指示劑，然后適當稀釋，約加水1倍，使最終的酸濃度為1N左右。

　　(3)標準蛋白質溶液:

　　精確稱取結晶牛血清清蛋白或 g—球蛋白，溶于蒸餾水，濃度為250 mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混濁，可改用0.9 % NaCl溶液。

　　2. 器材

　　(1)可見光分光光度計

　　(2)旋渦混合器

　　(3)秒表

　　(4)試管16支

　　(三)操作方法

　　1. 標準曲線的測定：取16支大試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分成兩組，分別加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升標準蛋白質溶液(濃度為250mg/ml)。用水補足到1.0毫升，然后每支試管加入5毫升試劑甲，在旋渦混合器上迅速混合，于室溫(20～25℃)放置10分鐘。再逐管加入0.5毫升試劑乙(Folin—酚試劑)，同樣立即混勻。這一步混合速度要快，否則會使顯色程度減弱。然后在室溫下放置30分鐘，以未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照，于700nm處測定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質的量為橫座標，吸光度值為縱座標，繪制出標準曲線。

　　注意：因Lowry反應的顯色隨時間不斷加深，因此各項操作必須精確控制時間，即第1支試管加入5毫升試劑甲后，開始計時，1分鐘后，第2支試管加入5毫升試劑甲，2分鐘后加第3支試管，余此類推。全部試管加完試劑甲后若已超過10分鐘，則第1支試管可立即加入0.5毫升試劑乙，1分鐘后第2支試管加入0.5毫升試劑乙，2分鐘后加第3支試管，余此類推。待最后一支試管加完試劑后，再放置30分鐘，然后開始測定光吸收。每分鐘測一個樣品。

　　進行多試管操作時，為了防止出錯，每位學生都必須在實驗記錄本上預先畫好下面的表格。表中是每個試管要加入的量(毫升)，并按由左至右，由上至下的順序，逐管加入。最下面兩排是計算出的每管中蛋白質的量(微克)和測得的吸光度值。

　　2. 樣品的測定：取1毫升樣品溶液(其中約含蛋白質20~250微克)，按上述方法進行操作，取1毫升蒸餾水代替樣品作為空白對照。通常樣品的測定也可與標準曲線的測定放在一起，同時進行。即在標準曲線測定的各試管后面，再增加3個試管。如上表中的8、9、10試管。

　　根據所測樣品的吸光度值，在標準曲線上查出相應的蛋白質量，從而計算出樣品溶液的蛋白質濃度。

　　注意，由于各種蛋白質含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質而變化。因而本測定法通常只適用于測定蛋白質的相對濃度(相對于標準蛋白質)。