一、實驗原理

　　植物患病組織內的真菌菌絲體，如果給予適宜的環境條件，除個別種類外，一般都能恢復生長和繁殖。植物病原菌的分離就是指通過人工培養，從染病植物組織中將病原真菌與其它雜菌相分開，并從寄主植物中分離出來，再將分離到的病原菌于適宜環境內純化，這個過程總稱植物病菌的分離培養。植物病原真菌的分離一般都是采用組織分離法，就是切取小塊病組織，經表面消毒和滅菌水洗過后，移到人工培養基上培養。

　　二、實驗目的

　　植物病原菌的分離培養是植物病理學實驗最基本的操作技術之一，它對原害鑒定，病原形態觀察、植物病害接種體的培養等方面都是經常使用的研究手段。通過本實驗，要求植物病原菌分離培養的一般原則和方法。

　　三、實驗材料及準備

　　1.分離材料：梨黑斑病(Alternaria kikuchiana)，柿樹圓斑病(Pestnlotia sp)及杉木炭疽病(Glomerella cingolata)新發病的病葉;楊樹爛皮病(Cytospora chrysosperma)國槐腐爛病(Dothiorella sp.)的帶有新病斑的枝條;油松種子。

　　2.分離用具(每小組為單位)

　　酒精燈4個，手術剪4把，眼科鑷4把，PDA培養基3瓶，培養皿(Φ9cm)24套，小燒杯(5ml)4個，大燒杯1個，斜面培養基12管，滅菌水4瓶，75%酒精瓶1個(內放脫脂棉球)0.1%升汞瓶1個，5%乳酸瓶(60ml)1個，火柴1盒，濕、干紗布各4張。

　　四、實驗方法及步驟

　　(一)分離前的準備工作

　　1.工作環境的清潔和消毒

　　分離培養一般在無菌室、無菌箱或無菌工作臺(超凈工作臺)上進行，無菌室和無菌箱要經過噴霧除塵，并用藥物或紫外線照射消毒(常用消毒藥物為70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等噴霧。若用紫外線燈照射則需20-30分鐘)。在沒有上述設備條件時，在清潔房間里關閉門窗，避免空氣流動，經過噴霧除去空氣及地面灰塵后進行操作，也可獲得較好的結果。工作前擦凈桌面，最好鋪上濕紗布。將所需用的物品按次序放在工作臺上，避免工作時走動，工作人員最好穿上滅菌后的工作服，帶上口罩，并用肥皂洗手，用70%酒精或0.1%新潔爾滅擦手。

　　2.分離用具的消毒

　　凡是和分離材料接觸的器皿(刀、剪、鑷、針等)都要隨時(至少在使用時)保持無菌，將這些用具浸于70%酒精中，使用時在燈焰上滅菌燒去酒精，如此2-3次(刀、剪、鑷等不宜在燈焰上燒時過長，以防退火)。再次使用時必須重復滅菌。培養皿、試驗等要經過干熱滅菌。培養基及洗滌或稀釋用蒸餾水都需要事先經過高壓蒸氣滅菌。

　　3.分離材料的選擇

　　用新發病的植株、器官或組織做為分離材料，可以減少腐生菌的污染。任何植物壞死部分的內部或表面，都可能有腐生微生物的孽生，所以一般斑點病害應從鄰近健全組織，即從病、健組織交界處獲得分離材料。

　　(二)植物病原菌的分離

　　1.葉斑類和枝桿病斑類(非維管束侵染)病原菌分離

　　首先選擇具有典型癥狀的新鮮病葉作為分離材料，按下述步驟操作：

　　①培養基平板制備：將PDA培養基在微波爐中加熱熔化驗，以無菌操作法將溶化過的培養基傾注入滅過菌的培養基中，每皿經12毫升，可形成2-3毫米厚的平板。(為防止細菌污染，倒碟前給每三角瓶內加6%乳酸4-6滴)。

　　②病葉或病枝經自來水沖洗，從病斑周轉1-2毫米處的健組織部位剪下(若為枝干，則將帶有病斑的皮層剝下，但)。

　　③取10毫升小燒杯經酒帶消毒，放入分離材料，倒入0.1%升汞液適量作表面消毒一分鐘，或用1%漂白粉消毒均可。

　　④消毒后傾出消毒液，用無菌水沖洗2——3，最后一次無菌水不要倒掉。

　　⑤用滅菌鑷，剪在無菌水中將分離材料剪成2——3毫米大小的方塊，每塊組織均應為病健相間組織。用滅菌鑷子夾取剪好的材料，放入培養基平板上，輕輕按壓。每皿4——5塊，排放均勻。

　　⑥用蠟筆在培養皿上注明分離代號，日期、姓名，將培養皿翻轉放置于23—25℃

　　⑦3-4日后挑選由分離材料上長出的典型而無雜菌的菌落，在菌落邊緣用移菌針挑取帶有菌絲的培養基一小塊，轉入試管斜面培養基中央，于25℃溫箱中培養。

　　2.種子內病菌的分離

　　將整粒種子或種子的一部分進行沖洗，再經表面消毒(升汞或漂白粉)，最后用滅菌水洗滌后移到人工培養基平板上培養(或者直接放在皿內保濕培養于25℃溫箱中)。

　　3.危害輸導組織病原的分離(以枯萎病為代表)

　　先將分離莖作表面消毒，然后用滅菌刀剝去表皮，剪取其中小塊變色的維管束組織，再用漂白粉進行表現消毒后，移于培養基平面上培養。

　　4.分離物的純化

　　前述方法獲得分離物，必須經過純化，才能成為培養，純化的方法有單孢子分離法和邊續稀釋培養法兩種，后者簡便，為了一般研究所常用。

　　連續稀釋法：對真菌材料來說，就是從典型菌落邊緣切取含有菌絲的培養基一小塊，移植于另一培養基平板上，待菌落形成后，再依此法移植。如此數次，直至菌落形態典型，無雜菌時即可移入斜面試管中培養保存。

　　附：

　　1、0.1%升汞液的配制：升汞1克，濃鹽酸2.5毫升;加水1000毫升。注意要先將升汞用鹽酸溶解，然后加水稀釋。

　　2、P.D.A培養基成分;馬鈴薯200克，葡萄糖10-20克，洋菜17-20克，水1000毫升。

　　3、水洋菜培養基成分，洋菜17-20克，水1000毫升。