保留時間不重現(xiàn)有兩種不同的情況：即保留時間漂移和保留時間波動。前者是指保留時間僅沿單方向發(fā)生變化，而后者指保留時間無固定規(guī)律的波動。將此兩種情況區(qū)分開來對找到問題的原因往往很有幫助。如，保留時間的漂移往往由柱老化引起;而柱老化不可能引起保留時間的無規(guī)律波動。事實(shí)上，保留時間漂移的多半原因是不同機(jī)理的色譜柱老化，如固定相流失(例如通過水解)，色譜柱污染(由樣品或流動相所致)等。保留時間漂移的幾種最常見的原因如下：

　　一 色譜柱平衡

　　如果我們觀察到保留時間漂移，首先應(yīng)考慮色譜柱是否已用流動相完全平衡。通常平衡需要10-20個柱體積的流動相，但如果在流動相中加入少量添加劑(如離子對試劑)則需要相當(dāng)長的時間來平衡色譜柱。

　　流動相污染也可能是原因之一。溶于流動相中的少量污染物可能慢慢富集到色譜柱上，從而造成保留時間的漂移。應(yīng)注意：水是很容易污染的流動相成分。

　　二 固定相穩(wěn)定性

　　固定相的穩(wěn)定性都是有限的，即使在推薦的PH 范圍內(nèi)使用，固定相也會慢慢水解。例如，硅膠基質(zhì)在pH4時水解穩(wěn)定性最好。水解速度與流動相類型和配體有關(guān)。雙官能團(tuán)配體和三官能團(tuán)配體比單官能團(tuán)配體的鍵合相要穩(wěn)定;長鏈鍵合相比短鏈鍵合相穩(wěn)定;烷基鍵合相比氰基鍵合相穩(wěn)定的多。

　　經(jīng)常清洗色譜柱亦會加速色譜柱固定相的水解。其他硅膠基質(zhì)鍵合相在水溶液環(huán)境中也可以發(fā)生水解，如氨基鍵合相等。

　　三 色譜柱污染!

　　保留時間漂移的另一個常見原因是色譜柱污染。HPLC色譜柱是非常有效的吸附性過濾器，它可以過濾并吸附流動相攜帶的任何物質(zhì)。污染源可以是：流動相本身，流動相容器，連接管、泵、進(jìn)樣器和儀器密封墊，以及樣品等。通常通過實(shí)驗可判斷污染的來源。

　　樣品中如果存在色譜柱上保留很強(qiáng)的組分，就可能是使保留時間漂移的潛在根源。這些根源通常是樣品基質(zhì)。如：配藥中的賦形劑，生化樣品(如血清)中的蛋白及類脂類化合物，食品樣品中的淀粉，環(huán)境水樣中的腐殖酸等。通常樣品中的強(qiáng)保留組分具有較高的分子量，在此情況下，保留時間漂移的同時或其后會有反壓的增加。可以通過使用固相提取(SPE)等樣品前處理方法來去除樣品基質(zhì)的影響。

　　避免色譜柱污染最簡單的方法是防患于未然。相比之下，找到問題的所在并設(shè)計有效的清洗步驟以去除污染物要困難的多。通常使用在給定色譜條件下的強(qiáng)溶劑，但并非所有污染物都可以在流動相中溶解。如THF可去除反相色譜柱中的許多污染物，但蛋白在THF中就不能溶解。DMSO常常用于去除反相色譜柱中的蛋白。

　　使用保護(hù)柱是個非常有效的方法。反沖色譜柱僅是不得已時采用的辦法。

　　四 流動相組成

　　流動相組成的緩慢變化也是保留時間漂移的常見原因。如流動相中易揮發(fā)組分的揮發(fā)及循環(huán)使用流動相等。

　　五 疏水坍塌

　　當(dāng)小孔徑、端基封口良好的反相填料色譜柱使用接近100%的水為流動相時，有時會發(fā)生分離突然喪失及被分析物質(zhì)保留明顯降低或完全不保留的現(xiàn)象，這就是疏水坍塌。此現(xiàn)象是由流動相不浸潤固定相表面而致。挽救的辦法實(shí)現(xiàn)用含大量有機(jī)組分的流動相浸潤固定相，再用高水含量的流動相進(jìn)行平衡。由是色譜柱長期儲存也會發(fā)生此現(xiàn)象。使用內(nèi)嵌極性基團(tuán)的反相色譜柱或非端基封口的色譜柱也可避免發(fā)生坍塌。