目的要求

　　1.掌握一般培養基制備的原則和要求。

　　2.熟悉一般培養基制備的過程。

　　操作步驟

　　一、培養基的制備原則和要求

　　培養基是根據各類微生物生長繁殖的需要，用人工方法把多種物質混合而成的營養物。一般用來分離、培養菌類。常用的培養基有基礎培養基、增菌培養基、選擇培養基、鑒別培養基和厭氧培養基。在制備培養基時，應掌握如下原則和要求：

　　(一)培養基必須含有細菌生長繁殖所需要的營養物質。所用的化學藥品必須純凈，稱取的份量務必準確。

　　(二)培養基的酸堿度應符合細菌生長要求。按各種培養基要求準確測定調節pH值。多數細菌生長的適宜pH值為7.2～7.6，呈弱堿性。

　　(三)培養基的滅菌時間和溫度，應按照各種培養基的規定進行，以保證滅菌效果及不損失培養基的必需營養成分。培養基經滅菌后，必須置37℃溫箱中培養24小時，無菌生長者方可應用。

　　(四)所用器皿須潔凈，忌用鐵或鋼質器皿，要求沒有抑制細菌生長的物質存在。

　　(五)制成的培養基應該是透明的，以便觀察細菌生長性狀以及其他代謝活動所產生的變化。

　　二、培養基制備過程

　　不同的培養基其制備方法也不同，一般包括以下步驟：

　　(一)準確稱量試劑 根據不同的菌類和用途，選擇適宜的培養基，培養基所需試劑必須純凈。

　　(二)校正pH值 將稱量好的培養基各種成分放入容器內，標記劃線，加熱溶解，補充水分，測定酸堿度，常用pH6.8～8.0的精密試紙或酸度計測定。用1N

　　NaOH和1N HCl調節pH值到適宜范圍內。

　　(三)過濾 將玻璃漏斗置鐵架上，再用紗布夾棉花或用濾紙放在漏斗中，將上述培養基倒入其中過濾至透明。

　　(四)分裝 將過濾后的培養基分裝于中試管或三角瓶內(試管內每支裝5mL;三角瓶中裝100～150ml)，塞好棉塞用牛皮紙包扎好，準備滅菌。

　　(五)滅菌

　　培養基的滅菌，常用高壓蒸汽滅菌法。一般微生物的營養細胞在水中煮沸后即被殺死，但細菌的芽胞有較強的抗熱性，須經高壓蒸汽滅菌才能達到徹底滅菌的目的。根據蒸汽溫度隨壓力升高而上升的原理，即壓力越大，蒸汽溫度就越高。因此，在同一溫度條件下，采用高壓蒸汽滅菌比干熱滅菌法效果要好。而且在濕熱情況下，菌體吸收水分后，其蛋白質易于凝固變性，因為蒸汽的穿透力強，殺菌效果好。

　　高壓蒸汽滅菌，一般采用15磅/平方(即1.05kg/cm2)壓力，此時的溫度是121.3℃。滅菌20～30分鐘后，可達到完全滅菌的目的。在進行滅菌的時候，首先要把滅菌鍋內的冷空氣排出，否則，冷空氣存在會降低鍋內的實際溫度，影響滅菌效果。

　　三、基礎培養基的制備

　　(一)牛肉浸液(肉水)

　　1.成分 新鮮牛肉 500g ，水1000 ml。

　　2.制法

　　(1)取新鮮牛肉，剔除肌膜、脂肪，切成小塊，用絞肉機絞碎。

　　(2)按上述比例加水，浸泡過夜(夏天應將浸泡液放置在低溫的地方，防止腐敗;如果沒有冷藏條件時，可省去浸泡過夜這一步)，其間應攪拌數次。

　　(3)次日取上液煮沸一小時，并不斷攪拌。

　　(4)補足蒸發的水分，用白布或絨布過濾后分裝于三角瓶中，準備滅菌。

　　(5)置高壓滅菌器內，15磅滅菌20～30分鐘，置低溫、暗處保存備用。

　　3.用途

　　用于制備各種培養基的基礎液。

　　(二)肉浸液肉湯(普通肉湯)

　　1.成分 肉水 1000 ml ，蛋白胨 10g，氯化鈉 5g，磷酸氫二鉀 2g。

　　2.制法

　　(1)將以上成份加溫溶于牛肉浸液中。

　　(2)調pH值為7.4～7.6。

　　(3)濾紙過濾后分裝。

　　(4)15磅20～30分鐘滅菌后備用。

　　3.用途 作一般細菌培養用。

　　(三)營養瓊脂培養基(普通瓊脂)

　　1.成分 肉水 1000ml，蛋白胨10g，磷酸氫二鉀 lg ，氯化鈉 5g，瓊脂 20g。

　　2.制法

　　(1)將上述成分混合后，加熱溶解，補足水份。

　　(2)校正pH值7.4～7.6。

　　(3)用紗布夾棉花過濾。

　　(4)分裝于中試管或三角瓶中。

　　(5)高壓滅菌20～30分鐘后，將中試管擺成斜面，保存備用。

　　3.用途 一般細菌分離培養、菌種保存或用作特殊培養基。

　　(四)半固體培養基 基本上與營養瓊脂的制備相同，僅將瓊脂量減少至0.5～0.7%(1000 ml中加5～7g瓊脂)即可。

　　(五)鮮血瓊脂

　　將滅菌的營養瓊脂加熱溶化，冷卻至45～50℃時，加入5～8%無菌脫纖鮮血(綿羊、黃牛、馬和兔等)，分裝于試管后立即擺成斜面、或傾注于平皿中，待凝固后，置37℃培養1～2日。有污染者廢棄;無菌者保存，置冰箱備用。

　　無菌脫纖維鮮血的制備：以無菌操作采取動物鮮血(綿羊、黃牛、馬從頸靜脈采血;兔則從心臟采血)，放入帶玻璃珠的無菌三角瓶內，搖動5～10分鐘，放冰箱中備用。