細胞凋亡(Apoptosis)，又稱細胞程序性死亡(PCD: Programmed Cell Death)，是指細胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，自己結束其生命的過程。它是一個主動的，高度有序的，基因控制的，一系列酶參與的過程。細胞凋亡概念提出至今還不到30年的時間，但由于它在保證多細胞生物的健康生存過程中扮演著關鍵角色，對個體的正常發育及細胞凋亡紊亂在病理學研究中的重要作用，引起了人們對其機制和組分的廣泛而深入地研究，成為目前生命科學界最為熱門話題之一，也是生命科學界乃至社會各界爭相投入的研究領域。從近年的SCI排名中我們可以看到，信號傳導方面的文章遠遠超過位于第二位的人類基因組方面的，而信號傳導中一個重要的前沿領域就是細胞凋亡的研究。隨著這方面研究的持續升溫，涌現出了大量新的技術和方法對細胞凋亡進行檢測，其中不少已經有商品化的產品出現，大大加速了研究的進程。具體來說，針對凋亡的不同階段有以下一些方法。

　　1. 早期檢測:

　　1) PS(磷脂酰絲氨酸)在細胞外膜上的檢測:

　　PS從細胞膜內側轉移到外側在細胞受到凋亡誘導后不久發生, 可能作為免疫系統的識別標志。AnnexinV，一個鈣依賴性的磷脂結合蛋白，能專一性的結合暴露在膜外側的PS，再通過簡單的顯色或發光系統進行檢測。由于這是一種凋亡早期的活細胞檢測(懸浮細胞和貼壁細胞都適用)，可與DNA染料或別的晚期檢測方法相結合來標記凋亡的發展階段。

　　美國著名生物試劑公司CLONTECH和INTERGEN公司分別開發了多種標記的Annexin V產品，簡便快速，10分鐘就可完成檢測。其中帶熒光標記的Annexin V-EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein)及Annexin V-FITC，靈敏度高，可作為FACS(流式細胞分選)方法篩選凋亡細胞的基礎。由于融合蛋白Annexin V-EGFP，EGFP與PS 的結合比例為1：1，還可進行定量檢測。除此之外，還提供生物素偶聯的Annexin V，可通過常用的酶聯顯色反應來檢測。另外，MACS公司將磁珠包被Annexin V，可采用磁分選方法篩選凋亡細胞。

　　2)細胞內氧化還原狀態改變的檢測：

　　這反應了細胞凋亡研究中相對較新的趨勢，研究什么樣的氧化還原環境引起下游事件的發生。CLONTECH公司的ApoAlertTM Glutathione Detection Kit通過熒光染料monochlorobimane(MCB)體外檢測凋亡細胞細胞質中谷光苷肽的減少來檢測凋亡早期細胞內氧化還原狀態的變化。正常狀態下,谷光苷肽(glutathione：GSH)作為細胞的一種重要的氧化還原緩沖劑。細胞內有毒的氧化物通過被GSH還原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH還原酶迅速還原。這一反應在線粒體中尤為重要，許多呼吸作用中副產物的氧化損傷將由此被去除。在Jurcat和一些其它類型的細胞中，細胞膜中有可被凋亡信號啟動的ATP依賴的GSH轉移系統。當細胞內GSH的排除非常活躍時，細胞液就由還原環境轉為氧化環境，這可能導致了凋亡早期細胞線粒體膜電位的降低，從而使細胞色素C(三羧酸循環中的重要組分)從線粒體內轉移到細胞液中，啟動凋亡效應器caspase的級聯反應。

　　由于 GSH與氧化還原作用及線粒體功能密切相關，此項檢測除了對研究細胞凋亡的起始非常有用外，還可用于心臟病、中風等疾病治療的研究。但有些細胞如：HeLa 和3T3細胞凋亡時沒有明顯的GSH水平的變化，不能用此法檢測。

　　3)細胞色素C的定位檢測

　　細胞色素C作為一種信號物質，在細胞凋亡中發揮著重要的作用。正常情況下，它存在于線粒體內膜和外膜之間的腔中，凋亡信號刺激使其從線粒體釋放至細胞液，結合Apaf-1 (apoptotic protease activating factor-1)后啟動caspase級聯反應：細胞色素C/Apaf-1復合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。細胞色素C氧化酶亞單位Ⅳ(cytochrome c oxidase subunit Ⅳ：COX4)是定位在線粒體內膜上的膜蛋白，凋亡發生時，它保留在線粒體內，因而它是線粒體富集部分的一個非常有用的標志。

　　ApoAlertTMCell Fractionation Kit不用超離心，可從凋亡和非凋亡細胞中快速有效分離出高度富集的線粒體部分，再進一步通過Western雜交用細胞色素C抗體和COX4抗體標示細胞色素C和COX4的存在位置，從而判斷凋亡的發生。

　　4) 線粒體膜電位變化的檢測：

　　在凋亡研究的早期，從形態學觀測上線粒體沒有明顯的變化。隨著凋亡機制研究的深入，發現線粒體凋亡也是細胞凋亡的重要組成部分，發生很多生理生化變化。例如，在受到凋亡誘導后線粒體轉膜電位會發生變化，導致膜穿透性的改變。MitoSensorTM，一個陽離子性的染色劑，對此改變非常敏感，呈現出不同的熒光染色。正常細胞中，它在線粒體中形成聚集體，發出強烈的紅色熒光。凋亡細胞中，因線粒體穿膜電位的改變，它以單體形式存在于細胞液中，發出綠色熒光。用熒光顯微鏡或流式細胞儀可清楚地分辨這兩種不同的熒光信號。CLONTECH公司的ApoAlert Mitochondrial Membrane Sensor Kit就采用這種原理來檢測線粒體膜電位的變化。但是，這種方法不能區分細胞凋亡或其他原因導致的線粒體膜電位的變化。

　　2. 晚期檢測：

　　細胞凋亡晚期中，核酸內切酶(某些Caspase的底物)在核小體之間剪切核DNA，產生大量長度在180-200 bp 的DNA片段。對于這一現象的檢測通常有以下兩種方法：

　　1) TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling)

　　通過DNA末端轉移酶將帶標記的 dNTP (多為dUTP)間接(通過地高辛)或直接接到DNA片段的3’-OH端，再通過酶聯顯色或熒光檢測定量分析結果。美國Intergen公司提供多種標記方法，直接熒光標記，地高辛介導熒光標記或過氧化物酶聯顯色，可做細胞懸液、福爾馬林固定或石蠟處理的組織、細胞培養物等多種樣本的檢測。其中，直接標記步驟少，操作簡便。而間接標記有信號放大的作用，檢測靈敏度高。

　　2) LM-PCR Ladder (連接介導的PCR檢測)

　　當凋亡細胞比例較小以及檢測樣品量很少(如活體組織切片)時，直接瓊脂糖電泳可能觀察不到核DNA的變化。CLONTECH公司的ApoAlert?LM-PCR Ladder Assay Kit通過LM-PCR(ligation-mediated PCR),連上特異性接頭，專一性地擴增核小體的梯度片段，從而靈敏地檢測凋亡時產生的核小體的梯度片段。此外，LM-PCR 檢測是半定量的，因此相同凋亡程度的不同樣品可進行比較。

　　上述兩種方法都針對細胞凋亡晚期核DNA斷裂這一特征，但細胞受到其它損傷(如機械損傷，紫外線等)也會產生這一現象，因此它對細胞凋亡的檢測會受到其它原因的干擾。

　　3) Telemerase Detection (端粒酶檢測)

　　這是相對來說推出較早，用得較多的一種方法。端粒酶是由RNA和蛋白組成的核蛋白，它可以自身RNA為模板逆轉錄合成端粒區重復序列，使細胞獲得“永生化”。正常體細胞是沒有端粒酶活性的，每分裂一次，染色體的端粒會縮短，這可能作為有絲分裂的一種時鐘，表明細胞年齡、復制衰老或細胞凋亡的信號。研究發現，90%以上的癌細胞或凋亡細胞都具有端粒酶的活性。Intergen公司的TRAP-eze Telemerase Detection Kit在1996年率先推出。它提供特定的寡核苷酸底物，分別與底物及端粒重復序列配對的引物。如果待測樣本中含有端粒酶活性，就能在底物上接上不同個數的6堿基(GGTTAG)端粒重復序列，通過PCR反應，產物電泳檢測就可觀察到相差六個堿基的DNA Ladder現象(參見圖4)。此外，Intergen公司還提供用酶聯免疫法(ELISA)檢測的試劑盒.

　　同樣，這種檢測方法也不專對細胞凋亡，檢測結果也不純反應細胞凋亡的發生。

　　3.mRNA水平的檢測

　　研究者們發現了很多在細胞凋亡時表達異常的基因，檢測這些特異基因的表達水平也成為檢測細胞凋亡的一種常用方法。據報道，Fas 蛋白結合受體后能誘導癌細胞中的細胞毒性T細胞(cytotoxic T cells)等靶細胞。Bcl-2 和bcl-X (長的) 作為抗凋亡(bcl-2 和bcl-X)的調節物，它們的表達水平比例決定了細胞是凋亡還是存活。一般多采用Northern雜交和RT-PCR走膠對它們進行檢測。隨著近年來熒光定量PCR技術的發展，用定量PCR技術來檢測基因表達水平無疑比之前者更快更準確。Intergen公司的Amplifluor? Apoptosis Gene Systems就根據這一新技術原理，通過檢測fas, bax-alpha 和 bcl-X (長的) 基因的 mRNA表達水平來進行細胞凋亡的檢測。

　　以上介紹了針對凋亡不同階段特征的檢測方法，隨著凋亡機制研究的深入，近年來還發展了許多針對特定的凋亡途徑的檢測，如抗體法，酶活性測定等等，Cell Signeling technology公司，DAKO公司，Santa-Cruz公司，Calbiochem & Oncogene公司都緊跟科研潮流，開發了大量的抗體及活性測定產品。我們將陸續報道這方面的技術方法與產品。