前言

　　本標準附錄A為資料性附錄。

　　本標準由浙江省海洋與漁業局提出并歸口。

　　本標準起草單位：農業部漁業環境及水產品質檢中心(舟山)。

　　本標準主要起草人：鄭斌、陳雪昌、劉士忠、金彩杏、鐘志、劉琴。

　　水產品中磺胺類殘留量的測定液相色譜法

　　范圍

　　本標準規定了水產品中磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶和磺胺甲基異噁唑殘留量的液相色譜測定方法。

　　本標準適用于水產品中磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶和磺胺甲基異噁唑殘留量的測定，其它磺胺類藥物的測定可以參照本標準。

　　規范性引用文件

　　下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內容)或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據本標準達成協議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。

　　GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法

　　原理

　　用乙酸乙酯提取，稀鹽酸反提取，正己烷脫脂，熒光胺衍生，反相色譜柱分離，熒光檢測器檢測，磺胺5-甲氧嘧啶為內標物，內標法定量。

　　試劑

　　本標準所用試劑在磺胺類藥物出峰處應無干擾峰，實驗用水應符合GB/T6682中一級水標準。

　　標準品：磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲基異噁唑，磺胺5-甲氧嘧啶，純度均大于98.0%。

　　丙酮：色譜純。

　　正己烷：色譜純。

　　乙酸乙酯：色譜純。

　　乙腈：色譜純。

　　甲醇：色譜純。

　　熒光胺：純度大于99.0%。

　　乙酸鈉：分析純。

　　冰乙酸：優級純。

　　鹽酸溶液：2mol/L，量取180mL鹽酸，加適量水并稀釋至1000mL。

　　乙酸鈉溶液：3.5mol/L，稱取28.7g無水乙酸鈉溶于蒸餾水中，定容至100mL。

　　熒光胺溶液：2mg/L，稱取0.03g熒光胺，加15mL丙酮，振搖至完全溶解，存放在暗處。現配現用。

　　標準儲備液：100mg/L，稱取標準品10mg(稱準至0.1mg)，用甲醇溶解并定容至100mL。避光冷藏保存，保存期為一個月。

　　混合標準中間液：1mg/L，移取標準儲備液各1.00mL，用甲醇稀釋并定容至100mL，在室溫下混勻。

　　內標儲備液：100mg/L，稱取磺胺5-甲氧嘧啶標準品10mg(稱準至0.1mg)，用甲醇溶解并定容至100mL。避光冷藏保存，保存期為一個月。

　　內標中間液：1mg/L，移取內標儲備液1.00mL，用甲醇稀釋并定容至100mL，在室溫下混勻。

　　混合標準使用液：取混合標準中間液20μL、40μL、100μL、200μL、400μL，分別加入內標中間液100μL，用2mol/L鹽酸(4.10)稀釋至2mL，配成濃度分別為0.01mg/L、0.02mg/L、0.05mg/L、0.10mg/L、0.20mg/L的混合標準使用液，其中內標濃度為0.05mg/L。

　　儀器與設備

　　液相色譜儀：配熒光檢測器。

　　電子天平：感量0.0001g。

　　電子天平：感量0.01g。

　　高速組織搗碎機。

　　均質機。

　　離心機。

　　旋渦混勻器。

　　氮吹儀。

　　往復式振蕩器。

　　聚丙烯離心管：15mL、50mL。

　　容量瓶：10mL、20mL、50mL、100mL、200mL、500mL、1000mL。

　　玻璃移液管：1mL、2mL、5mL、10mL。

　　巴斯德吸管。

　　色譜條件

　　色譜柱：ODS-C18，5μm，4.6mm×250mm，或同類型號色譜柱。

　　柱溫：45℃。

　　流動相：乙腈 乙酸溶液(38 62)，500mL水中加入冰乙酸調節pH至3.0配制成乙酸溶液。

　　流速：1mL/min

　　進樣量：20μL。

　　激發波長：405nm。

　　發射波長：495nm。

　　步驟分析

　　樣品制備

　　從原始樣品中取出部分有代表性的樣品，高速組織搗碎機搗碎。四分法縮分出不少于500g樣品，混勻，均分成兩份。裝入清潔容器，加封，標明標記。-18℃以下冷凍保存。

　　提取

　　將樣品解凍，稱取2.00g，置于50mL聚丙烯離心管，加入磺胺5-甲氧嘧啶標準中間液(4.16)100μL，用玻璃棒攪勻，再加乙酸乙酯10mL，均質機14000rpm均質1min，往復式振蕩器振動10min，3000rpm離心10min，將乙酸乙酯層小心轉移到15mL具塞刻度試管中，40℃以下氮氣吹至2mL。再向原離心管中加入乙酸乙酯10mL，旋渦混勻30s，振動10min，3000rpm離心10min，將乙酸乙酯層小心轉移到原15mL具塞刻度試管中，40℃以下氮氣吹至5mL。然后在試管中加入2.00mL2mol/L的鹽酸溶液，旋渦混勻1min，加蓋后振動10min，3000rpm離心8min，用巴斯德吸管移去乙酸乙酯層，在余液中加入正己烷5mL，旋渦混勻30s，3000rpm離心8min，用巴斯德吸管移去正己烷層，0.45μm微孔濾膜過濾，濾液備用。

　　衍生

　　向樣品瓶中加入200μL混合標準使用液或樣品提取液、200μL乙酸鈉溶液和80μL熒光胺溶液，旋渦混勻30s，20min后供液相色譜分析。

　　色譜分析

　　取衍生后的樣品提取液20μL進樣，記錄峰面積，響應值均應在儀器檢測的線性范圍之內。根據標準樣品的保留時間定性，內標法定量。磺胺類藥物色譜分析圖參見附錄A。

　　工作曲線

　　稱取空白樣品2.00g，分別添加混合標準中間液(4.14)20μL、40μL、100μL、200μL、400μL，樣品中每種磺胺殘留量分別為0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.05mg/kg、0.10mg/kg、0.20mg/kg，按7.2、7.3、7.4操作，以磺胺峰面積與內標物峰面積的比值為縱坐標，磺胺含量為橫坐標，繪制工作曲線。

　　計算

　　用色譜數據處理軟件或按下式計算樣品中磺胺殘留量：

　　式中：

　　X——樣品中磺胺殘留量，單位為毫克每千克(mg/kg);

　　s——樣品溶液中磺胺峰面積，單位為counts;

　　s1——樣品溶液中內標峰面積，單位為counts;

　　S——標準溶液中磺胺峰面積，單位為counts;

　　S1——標準溶液中內標峰面積，單位為counts;

　　x——加標樣品中磺胺殘留量，單位為毫克每千克(mg/kg)。

　　方法回收率

　　濃度范圍為0.010mg/kg～0.10mg/kg時，回收率見回收率表。

　　回收率表

　　名稱

　　回收率

　　磺胺嘧啶

　　88.0%～111.8%

　　磺胺甲基嘧啶

　　90.0%～110.8%

　　磺胺二甲基嘧啶

　　91.0%～110.1%

　　磺胺甲基異噁唑

　　107.0%～116.7%

　　方法檢出限

　　本方法檢出限為0.010mg/kg。

　　精密度

　　在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的15%。