【摘要】目的優化九節茶HPLC指紋圖譜分離條件。方法使用色譜柱KromasilC18(250mm×4.6mm，5μm)，流動相為甲醇-0.2%磷酸溶液，柱溫為25℃，流速為0.7ml/min，檢測波長為340nm，考察九節茶的最佳梯度洗脫條件。結果經優化的分離條件為：0～35min，甲醇由20%線性增至40%;35～65min甲醇由40%增至60%，65～75min甲醇由60%減至20%，75～78min甲醇保持20%，可使主要成分達到較好的分離。結論通過對九節茶HPLC指紋圖譜分離條件的優化，更有利于控制九節茶藥材的質量。

　　【關鍵詞】九節茶高效液相色譜指紋圖譜

　　九節茶系金粟蘭科植物草珊瑚Sarcandraglabra(Thunb.)Nakai的干燥全草，又名腫節風、接骨金粟蘭、草珊瑚、接骨木，為多年生常綠草本或亞灌木。九節茶味苦辛、性平、有小毒，有祛風通絡、活血散淤、止血止痛、接骨續筋之功用[1]，臨床應用廣泛，特別是對呼吸系統、消化系統的炎癥性疾患具有較高療效，還用于骨傷科疾病及各種癌癥。

　　《中國藥典》2005年版Ⅰ部對九節茶藥材的質量控制是采用HPLC測定其中異嗪皮啶的含量[2]，但是單一指標性成分的含量測定往往難以反映中藥整體質量，不能較全面反映中藥品質。有文獻報道過九節茶藥材的指紋圖譜的研究[3，4]，在實際應用中發現上述指紋圖譜的獲取方法重復性差。本文擬對九節茶的液相色譜指紋圖譜分離條件進行優化，從而為中藥九節茶質量控制提供更好的方法。

　　1材料與儀器

　　1.1材料九節茶藥材經廣州中醫藥大學新藥開發與研究中心高英主任中藥師鑒定為金粟蘭科植物草珊瑚Sarcandraglabra(Thunb.)Nakai的全草;甲醇為色譜純;水為液相用水;其他試劑均為分析純。

　　1.2儀器DionexSummit高效液相色譜儀(P680HPLCPump,ASI-100AutomatedSampledInjector,PDA-100PhtodiodeArrayDetecter,UVD170U,STH585ColumnOven)，Chromeleon數據處理系統,KromasilC18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm);超聲波清洗器(SB-5200，中國船舶工業總公司第七研究院第七二六研究所);R-114型旋轉蒸發儀(BuCHI，瑞士)。

　　2方法與結果

　　2.1供試品溶液的制備取藥材粗粉1.0g(過20目篩)，加水回流提取兩次，每次加水20ml，提取1h，濾過，合并濾液，蒸干，殘渣轉移至25ml量瓶中，加80%甲醇約20ml，超聲30min，放至室溫，用甲醇定容，離心，小心吸取上清液，用微孔濾膜過濾后備用。

　　2.2梯度洗脫條件的優化

　　2.2.1優化條件Ⅰ經過實驗，得到以下的初始條件：

　　圖1a條件：0～50min,甲醇由5%線性增至70%;50～60min甲醇由70%增至90%，進樣量為10μl，柱溫為25℃，流速為0.7ml/min。其色譜圖(見圖1a)可以看出，主要成分的色譜峰集中于10～30min內被洗脫，30～60min內未出現色譜峰，表明所有成分均已被洗脫。

　　圖1b條件：0～35min,甲醇由5%線性增至25%;35～60min甲醇由25%增至45%，進樣量為10μl，柱溫為25℃，流速為0.7ml/min。色譜圖(見圖1b)可以看出，主要成分的色譜峰集中于20～50min內被洗脫，但0～20min內幾乎沒有色譜峰出現，因此需要繼續優化。

　　2.2.2優化條件Ⅱ

　　圖2a條件：0～40min,甲醇由10%線性增至30%;40～60min甲醇由30%增至45%，進樣量為10μl，柱溫為25℃，流速為0.7ml/min。其色譜圖(見圖2a)可以看出，主要成分的色譜峰集中于5～50min內被洗脫，但峰與峰的重疊較大。

　　圖2b條件：0～40min,甲醇由15%線性增至35%;40～60min甲醇由35%增至50%，60～70min甲醇由50%減至15%，70～72min甲醇保持15%，進樣量為10μl，柱溫為25℃，流速為0.7ml/min。色譜圖(見圖2b)可以看出，色譜峰的分布有所改善，但峰與峰的分離狀況不理想。

　　圖1優化條件Ⅰ的HPLC圖(略)

　　圖2優化條件Ⅱ的HPLC圖(略)

　　2.2.3優化條件Ⅲ

　　圖3a條件：0～35min,甲醇由17.5%線性增至40%;35～60min甲醇由40%增至60%，60～70min甲醇由60%減至17.5%，70～72min甲醇保持17.5%，進樣量為10μl，柱溫為25℃，流速為0.7ml/min。其色譜圖(見圖3a)可以看出，色譜峰之間基本達到分離，且均勻分布在0～60min內，但部分峰有拖尾的現象。

　　圖3b條件：0～35min,甲醇由20%線性增至40%;35～65min甲醇由40%增至60%，65～75min甲醇由60%減至20%，75～78min甲醇保持20%，進樣量為10μl，柱溫為25℃，流速為0.7ml/min。色譜圖(見圖3b)可以看出，無論是色譜峰的分離度、分布均勻性及峰形均與指紋圖譜技術要求相符合。

　　圖3優化條件Ⅲ的HPLC圖(略)

　　2.3方法學考察為考察分析方法的可靠性，對其穩定性、儀器精密度、實驗方法重現性進行考察。

　　2.3.1精密度實驗取供試品溶液連續進樣5次，記錄指紋圖譜。以保留時間為49.5min的峰為參照物峰，計算共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD值分別在0.48%～0.92%和1.15%～1.97%之間，符合指紋圖譜要求。

　　2.3.2重現性實驗精密稱取藥材5份，照供試品溶液制備方法制備5份樣品溶液，分別進樣并記錄指紋圖譜。以保留時間為49.5min的峰為參照物峰，共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD值分別在0.45%～1.03%和1.41%～2.06%之間，基本符合指紋圖譜要求。

　　2.3.3穩定性實驗取供試品溶液分別于0，2，6，12，24h進樣分析，記錄色圖譜，以保留時間為49.5min的峰為參照物峰，計算共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD值分別為0.36%～0.96%和1.20%～2.33%之間，表明樣品溶液在24h內穩定。

　　2.3.4不同產地藥材的HPLC圖譜見圖4。

　　圖4不同產地藥材的指紋圖譜(略)

　　3討論

　　3.1流動相的選擇九節茶中的化學成分有倍半萜及其苷類、黃酮及其苷類、有機酸類、香豆素類，這些成分多具有一定的極性和酸性[5]。本實驗比較了乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸、乙腈-0.1%醋酸、乙腈-1%醋酸、甲醇-0.1%磷酸、甲醇-0.2%磷酸、甲醇-0.1%醋酸、甲醇-1%醋酸等流動相的分離效果。結果同一條件下甲醇較乙腈對九節茶提取物的分離效果較佳，0.2%磷酸溶液較其他酸溶液對九節茶提取物的分離效果較佳，因此選擇甲醇和0.2%磷酸作為流動相單元。

　　3.2柱溫的選擇在實驗過程中，發現柱溫對分離效果影響較大，同一條件下考察了20，25，30，35℃柱溫對九節茶提取物的分離效果的影響，結果25℃較佳。

　　3.3流速的選擇在同一條件下考察了0.6，0.7，0.8，1.0ml/min流速對九節茶提取物的分離效果的影響，結果0.7ml/min流速的分離效果較佳。

　　3.4檢測波長的選擇選擇340nm作為檢測波長[3]。

　　在進行等度洗脫時，如果溶劑的洗脫能力過強，則不能把主要成分的色譜峰分開;溶劑的洗脫能力弱時，雖然能夠分開，但保留時間太長、峰形不理想。為了得到分離度好、保留時間合適、峰形理想的色譜峰，只有選用梯度洗脫。

　　液相色譜條件中的柱溫、流速對色譜峰的影響不大，因而應主要調整流動相的組成、溶劑的比例及梯度陡度，從而使各色譜峰之間達到較好的分離。考察流動相的組成時，在反相色譜中,甲醇的洗脫強度比乙腈要小，因而甲醇酸水系統色譜峰的峰形和分離度都要好于乙腈酸水系統。同時磷酸比醋酸的酸性強，對藥材中的酸性成分電離的抑制性強，選用磷酸可以確保色譜峰不拖尾。

　　經實驗，優化條件Ⅲ得出的九節茶液相色譜圖的分離度、分布均勻性及峰形好，可用來評價不同產地、品種的九節茶的指紋圖譜的質量差異。