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暫無數據,詳情請致電:18819137158 謝謝!
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高效液相色譜法檢測黃曲霉毒素M1操作規程
[2011/12/27]
針對近期奶中出現的黃曲霉毒素M1超標問題,廣州深華生物公司提出以下快速解決方案。
1. 儀器
1.1 高效液相色譜儀配熒光檢測器
1.2 震蕩器(或高速攪拌器)
1.3 高速離心機
2. 試劑與試液
2.1 色譜甲醇
2.2 蒸餾水
2.3 乙腈+水(25+75)
2.4 石油醚
2.5 10%乙腈
2.6 氫氧化鈉溶液(0.5mol/L)
玻璃纖維濾紙(PriboFast免疫親和柱免費贈送)
3. 測定法
本法系用高效液相色譜法(GB/T 18980-2003)測定牛奶,奶粉等產品中的黃曲霉毒素M1,除另有規定外,按下列方法測定。
3.1色譜條件
色譜柱:C18柱,150×4.6mm,5um
檢測器:熒光檢測器;激發波長365nm,發射波長435nm;
流動相:乙腈-水(25:75)
流 速:1.0ml/min
進樣量:20ul
柱 溫:室溫
3.2 標準品溶液的配制
取黃曲霉毒素M1標準品,用乙腈稀釋成0.5ug/ml的標準儲備液。根據使用需要,準確吸取10μl、20μl、50μl、100μl、200μl的黃曲霉毒素標準儲備液,置5ml的容量瓶中,用流動相稀釋至刻度,配成相當于1ng/ml、2g/ml、5ng/ml、10g/ml、20ng/ml的標準工作液,即得。
3.3 樣品前處理
3.3.1牛奶
將100mL牛奶水浴加熱至40℃;
4000r/min離心15min,收集50mL清澈液待用;
3.3.2乳粉和粉狀嬰幼兒配方食品
稱取10g奶粉樣品,將100mL50℃水多次少量加入,攪拌,使奶粉充分溶解;
6000r/min離心15min,收集50mL清澈液待用;
3.3.3發酵乳(包括固體狀、半固體狀和帶果肉型)
稱取60 g混勻的試樣,用0.5mol/L 的氫氧化鈉溶液在酸度計指示下調pH至7.4;
用高速均質器在 9500 轉/分鐘,高速勻漿5 min
水浴加熱至40℃;
4000r/min離心15min,收集50mL清澈液待用
3.3.4干酪
稱取經切細、過10目圓孔篩混勻的試樣5g置于50mL離心管中,加2 mL水和30 mL甲醇;
用高速均質器在 9500r/分鐘,高速勻漿5 min;
超聲提取30 min;
在6000r/分鐘下離心15 min,收集上清液并移入250 mL分液漏斗中。
在分液漏斗中加入30 mL石油醚,振搖2 min;
待分層后,將下層移于50 mL燒杯中,棄去石油醚層。
重復用石油醚提取2次;。
將下層溶液移到100 mL圓底燒瓶中,減壓濃縮至約2 mL;
濃縮液倒入離心管中,燒瓶用乙腈-水溶液(1+4) 5 mL分2次洗滌,洗滌液一并倒入50 mL離心管中;
加水稀釋至約50 mL,在6000 轉/分鐘下離心 5 min,上清液供凈化處理。
3.3.5奶油
稱取5g試樣,置于50 mL燒杯中;
用20 mL石油醚將其溶解并移于250mL具塞錐形瓶中。
加20 mL水和30 mL甲醇,振蕩30 min后,將全部液體移于分液漏斗中;
待分層后,將下層溶液全部移到100 mL圓底燒瓶中,在旋轉蒸發儀中減壓濃縮至約5 mL,加水稀釋至約50mL,供凈化處理。
3.4 供試品溶液的制備
3.4.1 PriboFast® 黃曲霉毒素M1免疫親和柱的操作
將免疫親和柱連接于50.0mL玻璃注射器下。準確移取50.0mL凈化溶液注入玻璃注射器;
將空氣壓力泵與注射器連接,調節壓力使溶液以約2-3mL/min流速緩慢通過免疫親和柱,直至2~3mL空氣通過柱體;
更換10ml注射器與親和柱連接,在注射器中加入10ml水,調節壓力使水以約6mL/min流速清洗親和柱。
準確加入4mL色譜級乙腈洗脫,流速為1 mL/min~2mL/min,收集全部洗脫液于玻璃試管中,供檢測用。(建議將乙腈的量分2-4次加入。每次加入后,要讓甲醇充分浸泡柱子里的凝膠2分鐘。洗脫后的乙腈溶液,最好是水浴30℃加熱吹近干。用10%乙腈定容后上液相)
3.5 測定
精密量取1ng/ml、2g/ml、5ng/ml、10g/ml、20ng/ml的標準工作液各20ul,注入液相色譜儀,測定峰面積,以峰面積為縱坐標,濃度為橫坐標,繪制標準曲線。另精密量取供試品溶液20ul,注入液相色譜儀,測定峰面積,從標準曲線上讀出供試品中相當于黃曲霉毒素M1的量,計算,即得。
1.本實驗應有相應的安全、防護措施,并不得污染環境。
2.殘留有黃曲霉毒素M1的廢液或廢渣的玻璃器皿,應置于專用貯存容器(裝有10%氯酸鈉溶液)內,浸泡24小時以上,再用清水將玻璃器皿沖洗干凈。
1. 儀器
1.1 高效液相色譜儀配熒光檢測器
1.2 震蕩器(或高速攪拌器)
1.3 高速離心機
2. 試劑與試液
2.1 色譜甲醇
2.2 蒸餾水
2.3 乙腈+水(25+75)
2.4 石油醚
2.5 10%乙腈
2.6 氫氧化鈉溶液(0.5mol/L)
玻璃纖維濾紙(PriboFast免疫親和柱免費贈送)
3. 測定法
本法系用高效液相色譜法(GB/T 18980-2003)測定牛奶,奶粉等產品中的黃曲霉毒素M1,除另有規定外,按下列方法測定。
3.1色譜條件
色譜柱:C18柱,150×4.6mm,5um
檢測器:熒光檢測器;激發波長365nm,發射波長435nm;
流動相:乙腈-水(25:75)
流 速:1.0ml/min
進樣量:20ul
柱 溫:室溫
3.2 標準品溶液的配制
取黃曲霉毒素M1標準品,用乙腈稀釋成0.5ug/ml的標準儲備液。根據使用需要,準確吸取10μl、20μl、50μl、100μl、200μl的黃曲霉毒素標準儲備液,置5ml的容量瓶中,用流動相稀釋至刻度,配成相當于1ng/ml、2g/ml、5ng/ml、10g/ml、20ng/ml的標準工作液,即得。
3.3 樣品前處理
3.3.1牛奶
將100mL牛奶水浴加熱至40℃;
4000r/min離心15min,收集50mL清澈液待用;
3.3.2乳粉和粉狀嬰幼兒配方食品
稱取10g奶粉樣品,將100mL50℃水多次少量加入,攪拌,使奶粉充分溶解;
6000r/min離心15min,收集50mL清澈液待用;
3.3.3發酵乳(包括固體狀、半固體狀和帶果肉型)
稱取60 g混勻的試樣,用0.5mol/L 的氫氧化鈉溶液在酸度計指示下調pH至7.4;
用高速均質器在 9500 轉/分鐘,高速勻漿5 min
水浴加熱至40℃;
4000r/min離心15min,收集50mL清澈液待用
3.3.4干酪
稱取經切細、過10目圓孔篩混勻的試樣5g置于50mL離心管中,加2 mL水和30 mL甲醇;
用高速均質器在 9500r/分鐘,高速勻漿5 min;
超聲提取30 min;
在6000r/分鐘下離心15 min,收集上清液并移入250 mL分液漏斗中。
在分液漏斗中加入30 mL石油醚,振搖2 min;
待分層后,將下層移于50 mL燒杯中,棄去石油醚層。
重復用石油醚提取2次;。
將下層溶液移到100 mL圓底燒瓶中,減壓濃縮至約2 mL;
濃縮液倒入離心管中,燒瓶用乙腈-水溶液(1+4) 5 mL分2次洗滌,洗滌液一并倒入50 mL離心管中;
加水稀釋至約50 mL,在6000 轉/分鐘下離心 5 min,上清液供凈化處理。
3.3.5奶油
稱取5g試樣,置于50 mL燒杯中;
用20 mL石油醚將其溶解并移于250mL具塞錐形瓶中。
加20 mL水和30 mL甲醇,振蕩30 min后,將全部液體移于分液漏斗中;
待分層后,將下層溶液全部移到100 mL圓底燒瓶中,在旋轉蒸發儀中減壓濃縮至約5 mL,加水稀釋至約50mL,供凈化處理。
3.4 供試品溶液的制備
3.4.1 PriboFast® 黃曲霉毒素M1免疫親和柱的操作
將免疫親和柱連接于50.0mL玻璃注射器下。準確移取50.0mL凈化溶液注入玻璃注射器;
將空氣壓力泵與注射器連接,調節壓力使溶液以約2-3mL/min流速緩慢通過免疫親和柱,直至2~3mL空氣通過柱體;
更換10ml注射器與親和柱連接,在注射器中加入10ml水,調節壓力使水以約6mL/min流速清洗親和柱。
準確加入4mL色譜級乙腈洗脫,流速為1 mL/min~2mL/min,收集全部洗脫液于玻璃試管中,供檢測用。(建議將乙腈的量分2-4次加入。每次加入后,要讓甲醇充分浸泡柱子里的凝膠2分鐘。洗脫后的乙腈溶液,最好是水浴30℃加熱吹近干。用10%乙腈定容后上液相)
3.5 測定
精密量取1ng/ml、2g/ml、5ng/ml、10g/ml、20ng/ml的標準工作液各20ul,注入液相色譜儀,測定峰面積,以峰面積為縱坐標,濃度為橫坐標,繪制標準曲線。另精密量取供試品溶液20ul,注入液相色譜儀,測定峰面積,從標準曲線上讀出供試品中相當于黃曲霉毒素M1的量,計算,即得。
1.本實驗應有相應的安全、防護措施,并不得污染環境。
2.殘留有黃曲霉毒素M1的廢液或廢渣的玻璃器皿,應置于專用貯存容器(裝有10%氯酸鈉溶液)內,浸泡24小時以上,再用清水將玻璃器皿沖洗干凈。