一摘要：

　　1.1實驗內容：

　　厭氧菌的分離、培養及鑒定;

　　1.2目的：

　　1掌握厭氧菌的分離、培養及活菌計數的一般方法。

　　了解厭氧菌菌鑒定的一般方法。

　　2復習并鞏固平時所學的微生物知識與技能。

　　3培養獨立思考、設計和動手實驗的能力。

　　二介紹：

　　厭氧微生物在自然界分布廣泛，種類繁多，其生理作用日益受到人們的重視。

　　專性厭氧菌，對氧氣非常敏感，因此，他們的分離、培養及活菌計數的關鍵是提供無氧和低氧化還原電勢的培養環境。

　　厭氧菌的培養：

　　在培養厭氧菌時，最需要控制的是厭氧條件，在pH=7.0,O2的濃度與1atm的氧平衡時，O2——O2-反應的電位是0.81V，因此，在-0.33V時，O2濃度是大氣壓中O2濃度的10-75。每升飽和了空氣的水中含有1.48×10-55個O2。所以說，要保證厭氧菌培養時的低電位是很重要的。

　　厭氧菌的培養方法很多，如厭氧箱法、厭氧袋法、厭氧罐法。這些方法都需要特定的除氧措施，操作步驟多，較繁瑣。本實驗介紹的是一種簡便的試管培養法——亨蓋特厭氧滾管技術，亨蓋特厭氧滾管技術是美國微生物學家亨蓋特于1950年首次提出并應用于瘤胃厭氧微生物研究的一種厭氧培養技術因此他是世界上第一個分離純化厭氧菌的人。

　　以后這項技術又經歷了幾十年的不斷改進，從而使亨蓋特厭氧技術日趨完善，并逐漸發展成為研究厭氧微生物的一套完整技術，而且多年來的實踐已經證明它是研究嚴格、專性厭氧菌的一種極為有效的技術。該技術的優點是：預還原培養基制好后，可隨時取用進行試驗;任何時間觀察或檢查試管內的菌種都不會干擾厭氧條件。

　　三實驗材料與設備：

　　3.1分離與培養：

　　3.1.1菌種：待測樣品;

　　3.1.2培養基：改良的PRAS培養基(氮素自加)

　　[配方組成——NH4CL1g,MgCl20.1g,K2HPO40.4g,KH2PO40.2g,甲酸鈉5g,乙酸鈉5g,甲醇3.5ml,Ph值為7.0,蒸餾水1000ml,1%的樹脂刃天青(還原指示劑)1ml,121攝氏度滅菌20min.使用前每5ml培養基加入1%Na2S(還原劑)和5%NaHCO3及3000u/ml青霉素液(抑制劑)各0.1ml]

　　3.1.3試劑：冰塊Na2SNaHCO3

　　3.1.4器材：高純氮氣厭氧管厭氧手套箱注射器恒溫培養箱銅柱除氧系統定量加樣器厭氧罐超聲波破碎儀酒精燈冰塊水浴鍋記號筆振蕩器等

　　3.2菌種的鑒定：

　　3.2.1菌種：待測菌

　　3.2.2培養基;糖發酵培養基、蛋白胨水培養基、淀粉培養基(液體);

　　3.2.3試劑;乙醚吲哚試劑盧戈氏碘液;

　　3.2.4器材：超凈工作臺恒溫培養箱高壓蒸汽滅菌鍋接種環移液管載玻片顯微鏡等

　　四、實驗方法與步驟：

　　4.1分離與培養

　　4.1.1銅柱系統除氧

　　銅柱是一個內部裝有銅絲或銅屑的硬質玻璃管。此管的大小為40～400mm，兩端被加工成漏斗狀，外壁繞有加熱帶，并與變壓器相連來控制電壓和穩定銅柱的溫度。銅柱兩端連接膠管，一端連接氣鋼瓶，另一端連接出氣管口。由于從氣鋼瓶出來的氣體如N2、CO2和H2等都含有微量O2，故當這些氣體通過溫度約360℃的銅柱時，銅和氣體中的微量O2化合生成CuO，銅柱則由明亮的黃色變為黑色。當向氧化狀的銅柱通入H2時，H2與CuO中的氧就結合形成H2O，而CuO又被還原成了銅，銅柱則又呈現明亮的黃色。此銅柱可以反復的使用，并不斷起到除氧的目的。當然H2源也可以由氫氣發生器產生。

　　4.1.2預還原培養基及稀釋液的制備

　　在無氧無菌的超凈厭氧手套箱中的條件下，制作預還原培養基及稀釋液時，先將配置好的培養基和稀釋液煮沸驅氧，而后用半定量加樣器趁熱分裝到螺口厭氧試管中，一般瓊脂培養基裝4.5～5.0mL，稀釋液裝9mL，并插入通N2氣的長針頭以排除O2。此時可以清楚的看到培養基內加入的氧化還原指示劑—刃天青由藍到紅最后變成無色，說明試管內已成為無氧狀態，然后蓋上螺口的丁烯膠塞及螺蓋，于滅氧罐中滅菌備用。

　　4.1.3分離

　　(1)編號

　　取五支無菌水試管，分別用記號筆標明10-1、10-2……10-5。

　　(2)稀釋

　　在無氧無菌的超凈厭氧手套箱中的條件下，用無菌注射器吸取1mL混合均勻的液體樣品，加入裝有預還原生理鹽水的厭氧試管中，用震蕩器將其混合均勻，制成10-1稀釋液。用無菌注射器吸取1mL10-1稀釋液至另一裝有9mL生理鹽水的厭氧試管中，制成10-2稀釋液。依此進行10倍系列稀釋，至10-6，制成不同樣品稀釋液。通常選10-4、10-5、10-6三個稀釋度進行滾管計數。

　　(3)滾管分離

　　1)滾管

　　將無氧無菌的瓊脂培養基在沸水浴中溶化，置46-50℃恒溫的水浴中，待用，當培養基從瓶中取出時，要用N2在培養基內中充氣。再在試管中用N2充氣，趕走所有管內空氣，然后把培養基加入管內，立即塞上瓶塞。待瓶塞塞入管內，及時拔出充氣針頭。用無菌注射器吸取10-4、10-5、10-6三個稀釋度各0.1mL，分別注入待用的試管中，然后將其平放于盛有冰水的瓷盤中迅速滾動，帶菌的溶化瓊脂在試管內壁會即刻形成凝固層。

　　2)分離純化

　　生成的菌落需挑取出來，鏡檢其形態及純度。如尚未獲得純培養物，需再次稀釋滾管，并再次挑取菌落，直至獲得純培養物為止。待挑取的單菌落預先在放大鏡下觀察確定，做好標記。然后將培養基試管固定于適當的支架上，打開試管膠塞，同時迅速將氣流適當、火焰滅過菌的氮氣長針頭插入管內。同時，另一液體厭氧管去掉膠塞插入另一滅過菌的通氣針頭。將準備好的彎頭毛細管小心插入固體培養基內，找準待挑菌落，輕輕吸取，轉移至液體試管內，加塞。37℃培養，培養24h或更長時間或待培養液混濁后檢查已分離培養物的純度。

　　3)劃線分離

　　將試管橡皮塞的一端在火焰上灼燒一下，挨著打氣針塞住管口，在針頭快速取下前，通氣15-20s，管口一端在火焰上燒片刻。旋緊管塞，劃線后的卷管直立保溫，使用CO2:H2=80:20,因為CO2比空氣重，開啟后管塞不致有空氣殘留。劃線后的滾管，置34-37度下培養，便可長出菌落。

　　4.1.4鏡檢與計數

　　(1)鏡檢

　　挑取特征性菌落制片，革蘭氏染色后鏡檢，觀察菌體形態。

　　(2)計數

　　液體純培養物經系列稀釋后，按上述滾管法培養。然后對固體滾管計數，計算每克或每毫升樣品中含有厭氧菌數量cfu/g(mL)樣品=A×10ml×X/10×D

　　A-0.1mL滾管計數的實際平均值;

　　X-鏡檢呈現為厭氧菌的數目;

　　X/10-菌落中厭氧菌的概率;

　　D-稀釋倍數

　　4.2菌種的鑒定

　　4.2.1糖發酵試驗

　　糖發酵實驗是最常用的生化反應，在腸道細菌鑒定上尤為重要。絕大多數細菌都能利用糖類作為碳源和能源，但是它們在分解糖的能力上有很大差異，有些細菌能分解糖并產酸(如乳酸、醋酸、丙酸等)和氣體(如氫、甲烷、二氧化碳等);有些細菌只產酸不產氣。例如大腸桿菌能分解乳糖和葡萄糖產酸并產氣;傷寒桿菌能分解葡萄糖產酸不產氣，不能分解乳糖;普通變形桿菌分解葡萄糖產酸產氣，不能分解乳糖。酸的產生可以利用指示劑來斷定。在配制培養基時預先加入溴甲酚紫[pH5.2(黃色)—6.8(紫色)]，當發酵產酸時，可使培養基由紫色變為黃色。氣體的產生可由發酵管中倒置的德漢氏小管中有無氣泡來證明。

　　具體實驗步驟：

　�、賹⒕�液進行適當稀釋，之后在無菌環境下，取一定量的稀釋液注入生化鑒定管中，用無菌封口膜封口。

　�、趯⒔臃N后的鑒定管放入厭氧罐中，充足氮氣后放入37℃恒溫培養箱培養。

　　③24h后觀察各管中液體顏色變化及產氣情況。

　　4.2.2蛋白質分解實驗

　　①將菌液進行適當稀釋，之后在無菌環境下，取一定量的稀釋液注入生化鑒定管中，用無菌封口膜封口。

　�、趯⒔臃N后的鑒定管放入厭氧罐中，充足氮氣后放入37℃恒溫培養箱培養。

　�、�24h后各管分別進行米倫氏反應、吲哚反應、黃色反應和坂口反應等。

　　4.2.3淀粉水解實驗

　�、賹⒕�液進行適當稀釋，之后在無菌環境下，取一定量的稀釋液注入生化鑒定管中，用無菌封口膜封口。

　　②將接種后的鑒定管放入厭氧罐中，充足氮氣后放入37℃恒溫培養箱培養。

　�、�24h后于各管中加入適量盧戈氏碘液觀察淀粉的水解情況。

　　五注意事項及注釋：

　　1注射器在使用前必須經過121℃、20min滅菌。

　　2注意無菌操作，保持手和培養管的清潔。每次接種前需用酒精棉球將厭氧管蓋子擦一遍。

　　3用注射器吸取菌懸液注入固體培養基后，如需再次吸取，應快速將注射器插入厭氧管中，以防止針頭污染。

　　4樹脂刃天青(resazurin)既是還原劑又是指示劑，它可以把培養基中殘留的溶解氧去除，其氧化還原電位指示敏感范圍為-42mV。有氧時呈紫色或粉紅色，無氧時呈無色(培養基的顏色)，它是較為理想的氧化還原電位指示劑和培養嚴格厭氧菌不可缺少的。

　　5培養基中加入的青霉素是用來抑制其它細菌生長的，因為厭氧菌的細胞壁成分為假肽聚糖，不受青霉素影響。

　　6注射器在使用前必須先用培養基上面的氣體沖洗、填充，然后插入培養基的下層，以保證當培養基移入試管時，就處于無氧氣體層的下面。