為了對以個特定序列進行PCR做重復檢測,需要三個不同的區(qū)域,每一個區(qū)域的具體技術操作和試劑在下面詳細列出.

　　1、樣品準備區(qū)

　　這個區(qū)域專門用作樣品的準備，在制備和操作用于核酸提取的試劑時應該采

　　取預防措施：

　　1)PCR產物和帶有要擴增序列的DNA克隆不能在這個房間操作。

　　2)組織培養(yǎng)物、組織標本和血清樣品都帶進樣品準備間處理，以根據(jù)應用的需要提取DNA或RNA。

　　3)用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。

　　4)DNA樣品應該用有專門的防護或正壓活塞式移液管操作，以防止在吸取樣品時有氣溶膠遺留。

　　5)大體積樣品應該用單獨包裝的無菌一次性移液管吸取。

　　6)管子打開前都要簡短離心以減少氣溶膠的產生，而且管子不能用力崩開，這樣會產生氣溶膠。

　　7)任何時候都應該穿實驗服和帶手套，手套要經常更換，尤其在抽提過程中每一步之間都要更換。實驗服要專門用于樣品準備間，經常清洗。

　　2、樣品準備和RNA-PCR

　　RNA-PCR的額外步驟需要額外的樣品操作，這樣增加了樣品之間污染的機會。為了避免這一問題，反轉錄一步可以在樣品準備區(qū)進行。在RNA-PCR中應用UNG以防止污染的方法也有報道。

　　3、前PCR區(qū)

　　必須有專門用于準備各種反應的區(qū)域，這個區(qū)域必須保持干凈，而且沒有來自克隆和樣品準備的污染。前PCR區(qū)必須要有試劑和準備，特別是專門用于前PCR區(qū)的正壓活塞式移液管。

　　4、PCR實驗室試劑的操作

　　1)所用的所有溶液都應該沒有核酸和(或)核酸酶(DNase和RNase)污染。

　　2)所有PCR試劑中使用的水都應該是高質量的-新鮮蒸餾的去離子水，用0.22μm過濾的，并且是高壓滅菌。

　　3)在20℃到25℃貯存的試劑建議加點像疊氮鈉一類的抗微生物劑，在擴增試劑或樣品制備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑制擴增反應。

　　4)所用試劑都應該以大體積配制，實驗一下看試劑是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量進行貯存。

　　5)所有試劑和樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子。

　　6)新配制的試劑在用于準備新的標本之前應該加以檢驗。

　　7)樣品準備和前PCR區(qū)所使用的移液管在不使用時都應該小心保存。

　　5、在前PCR區(qū)建立PCR混合物

　　1)可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分裝并保存在-20℃或4℃，在實驗室只涉及到擴增一種或少數(shù)幾種特異序列時這樣做很有用。

　　2)如果你的實驗室使用多套引物，以致于配制包括所有試劑的單一反應混合物不夠經濟，可以考慮分裝保存夠一天的PCR成分。

　　3)作為一個規(guī)則，應該保存一套陰性、弱陽性和強陽性對照樣品來分析樣品配制和PCR前過程的效率和潔凈程度。而且，你也希望通過使用一個已知的弱陽性樣品來驗證你的樣品緩沖液以證明里面不含擴增抑制物。

　　4)陰性樣品要與每組樣品同時做，以分析是否存在樣品與樣品之間的污染以及是否存在PCR產物的污染，陰性對照應該包括核酸以外的所有試劑。

　　5)當做陽性對照時，有兩個理由決定了應該使用最少數(shù)量的核酸。

　　6)由于必須有對照反應，對照模板的特點應該予以考慮。

　　6、控制污染的方法

　　已設計出很有力的酶學方法用來消除一種形式的污染—使用UNG，這一技術能有效地消除由PCR產物引起的污染。另一種控制污染的方法是使用紫外線，這種方法不能完全消除污染問題，但可以將污染降低幾個數(shù)量級。

　　7、PCR儀的位置

　　8、后PCR區(qū)

　　PCR完成以后，需要分析樣品并解釋數(shù)據(jù)，應該留出一個專門用于反應后處理樣品的地方。后PCR活動中使用的所用試劑、一次性耗材和儀器都必須是專門用于這一目的，決不能把實驗室這一區(qū)域的試劑或儀器用于任何前PCR活動