結晶紫法活性測定

　　1、取對數生長期的人胰腺癌SW1990細胞，用0.25%胰酶(以無鈣鎂離子PBS溶液配制，pH7.4)消化后，加進RPMI-1640培養基(10%新生牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素，pH7.2)奏樂細胞，使形成細胞懸液。進行細胞計數，使細胞數為2~2.5×105個/ml。接種于96孔細胞培養板，100μl/孔。接種細胞時須不斷搖動細胞懸液，以保證各孔細胞數的均勻一致。96孔板放置于37℃、5%CO2培養箱中培養22h，觀察到孔中細胞長滿70~80%。

　　2、在上述RPMI-1640完全培養基中加進放線菌素D，使終濃度為1.5μg/ml，配成樣品稀釋液。取此稀釋液900μl至Eppendorf管中，另在9個5ml管中加進700μl稀釋液。

　　3、用完全培養基將基因工程人腫瘤凋亡素樣品(上海恰爾生物技術有限公司研制，批號：0304，凍干粉劑，蛋白濃度：2mg/支)復溶至1000μl(液體樣品測定蛋白濃度后，直接進行下一步操縱)，取出100μl至已裝有900μl稀釋液的Eppendorf管中，充分混勻，盡量不起泡沫。再從此管中吸出100μl至下一管中，如此反復n次(即測定前10倍稀釋若干次，直到與估計活性相接近時)。

　　4、從最后稀釋的Eppendorf管中吸出700μl樣品至已裝有700μl稀釋液的5ml管中，充分混勻。再從此管中吸出700μl至下一管同樣裝有700μl稀釋液的5ml管中，如此反復9次(即測定時倍比稀釋樣品)。

　　5、棄往96孔板中舊的培養基，從第一個5ml管中吸取已稀釋的樣品100μl至第2排細胞孔中，每個稀釋度作6復孔(n=6);從第二個5ml管中吸取的樣品加進第3排細胞中，依此類推，直至第10排孔結束。第1排中不含細胞，加進100μl/孔含有放線菌素D的稀釋液作空缺對照;第11排加100μl/孔稀釋液作細胞對照;第12排加不含放線菌素D的RPMI-1640完全培養基。

　　6、將加好樣品的96孔板置37℃、5%的CO2培養箱中繼續培養22h，顯微鏡下觀察細胞形態變化，初步判定結果。

　　7、棄除培養板中的培養基，每孔加進100μl染色液(1.5mmol/L結晶紫)染色30min。洗往染色液，甩往水分并在吸水紙上拍打以使干燥。沖洗程度以在吸水紙上拍打時，沒有顏色出現為宜。

　　8、充分干燥后，每孔加進100μl33%濃度的冰醋酸，在振蕩儀上充分振蕩使結晶溶解。設定λ=595nm酶聯檢測儀測定各孔的吸光值，據此數據進行統計學處理，計算出對細胞50%殺傷時所需的基因工程人腫瘤凋亡素的濃度。

　　[活性計算]

　　活性單位定義：在上述測定條件下，以50%SW1990腫瘤細胞被殺傷時，為基因工程人腫瘤凋亡素的1個活性單位。

　　1、樣品的稀釋度取常用對數。

　　2、根據對應的細胞毒活性(光密度值)與稀釋度的對數，進行線性回回，得到計算公式y=ax b，分析相關系數R值，符合統計學要求者進行下一步分析。

　　3、代進50%殺傷時的光密度值(即第11排細胞光密度值的一半)，計算出稀釋倍數的對數，再求出稀釋倍數。

　　4、根據原樣品濃度及稀釋倍數計算出基因工程人腫瘤凋亡素對細胞50%殺傷時的濃度，再算出比活性。

　　5、其他細胞的檢測方法同上，計算時根據對SW1990標定的基因工程人腫瘤凋亡素活性單位，先求出對細胞50%殺傷時的所需活性單位，再根據基因工程人腫瘤凋亡素對SW1990細胞殺傷的比活性算出相應的盡對量。

　　[計算結果]

　　0304批原液：比活為：1.03×107活性單位/mg

　　蛋白的生物活性及結構測定方法

　　生物活性測定[37,38]是將人胰腺癌1990細胞以2×105個/ml種進96孔細胞培養板，37℃5%CO2培養箱培養4-6小時，用完全培養液(加有1.2μg/m的放線菌素D)做梯度稀釋的樣品加進細胞板(n=3)。置37℃5%CO2培養箱，18h后棄上清，以結晶紫固定液(結晶紫0.5%，甲醛8%，NaCl0.1%，乙醇20%)染色15min，蒸餾水洗往結晶紫。每孔再加進200μ33%的乙酸，旋渦混勻，置酶聯儀讀出D(595)值，以未加細胞的空缺孔為D本底。根據活性單位定義：使培養孔中的細胞50%死亡為一個單位。

　　MTT法——活性測定

　　1、接種細胞：用0.25%胰蛋白酶消化單層培養細胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液配成單個細胞懸液，以每孔103-104個細胞接種于96孔板中，每孔體積200μl。

　　2、培養細胞：將培養板移進CO2培養箱中，在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下，培養3-5天。(培養時間取決于實驗目的和要求)

　　3、呈色：培養第3-5天后，每孔加進MTT溶液(5mg/mL)20μl，37℃，繼續孵育4h，終止培養，小心吸棄孔內培養液上清。每孔加進150μlDMSO(二甲基亞砜)，振蕩10min，使結晶物充分溶解。

　　4、比色：選擇490nm波長，在酶標儀上測定個孔吸收值，記錄結果。