一 摘要：

　　1.1 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：

　　厭氧菌的分離、培養(yǎng)及鑒定;

　　1.2 目的：

　　1 掌握厭氧菌的分離、培養(yǎng)及活菌計(jì)數(shù)的一般方法。

　　了解厭氧菌菌鑒定的一般方法。

　　2 復(fù)習(xí)并鞏固平時(shí)所學(xué)的微生物知識(shí)與技能。

　　3 培養(yǎng)獨(dú)立思考、設(shè)計(jì)和動(dòng)手實(shí)驗(yàn)的能力。

　　二 介紹：

　　厭氧微生物在自然界分布廣泛，種類繁多，其生理作用日益受到人們的重視。

　　專性厭氧菌，對(duì)氧氣非常敏感，因此，他們的分離、培養(yǎng)及活菌計(jì)數(shù)的關(guān)鍵是提供無氧和低氧化還原電勢的培養(yǎng)環(huán)境。

　　厭氧菌的培養(yǎng)：

　　在培養(yǎng)厭氧菌時(shí)，最需要控制的是厭氧條件，在pH=7.0,O2的濃度與1atm的氧平衡時(shí)，O2——O2-反應(yīng)的電位是0.81V，因此，在-0.33V時(shí)，O2濃度是大氣壓中O2濃度的10-75。每升飽和了空氣的水中含有1.48×10-55個(gè)O2。所以說，要保證厭氧菌培養(yǎng)時(shí)的低電位是很重要的。

　　厭氧菌的培養(yǎng)方法很多，如厭氧箱法、厭氧袋法、厭氧罐法。這些方法都需要特定的除氧措施，操作步驟多，較繁瑣。本實(shí)驗(yàn)介紹的是一種簡便的試管培養(yǎng)法——亨蓋特厭氧滾管技術(shù)，亨蓋特厭氧滾管技術(shù)是美國微生物學(xué)家亨蓋特于1950年首次提出并應(yīng)用于瘤胃厭氧微生物研究的一種厭氧培養(yǎng)技術(shù) 因此他是世界上第一個(gè)分離純化厭氧菌的人。

　　以后這項(xiàng)技術(shù)又經(jīng)歷了幾十年的不斷改進(jìn)，從而使亨蓋特厭氧技術(shù)日趨完善，并逐漸發(fā)展成為研究厭氧微生物的一套完整技術(shù)，而且多年來的實(shí)踐已經(jīng)證明它是研究嚴(yán)格、專性厭氧菌的一種極為有效的技術(shù)。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是：預(yù)還原培養(yǎng)基制好后，可隨時(shí)取用進(jìn)行試驗(yàn);任何時(shí)間觀察或檢查試管內(nèi)的菌種都不會(huì)干擾厭氧條件。

　　三 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備：

　　3.1 分離與培養(yǎng)：

　　3.1.1菌種：待測樣品;

　　3.1.2 培養(yǎng)基：改良的PRAS培養(yǎng)基(氮素自加)

　　[配方組成——NH4CL 1g,MgCl2 0.1g,K2HPO4 0.4g,KH2PO4 0.2g,甲酸鈉5g,乙酸鈉5g,甲醇3.5ml,Ph值為7.0,蒸餾水1000ml,1%的樹脂刃天青(還原指示劑)1ml,121攝氏度滅菌20min.使用前每5ml培養(yǎng)基加入1%Na2S(還原劑)和5%NaHCO3及3000u/ml青霉素液(抑制劑)各0.1ml]

　　3.1.3 試劑：冰塊 Na2S NaHCO3

　　3.1.4 器材：高純氮?dú)?nbsp;厭氧管 厭氧手套箱 注射器 恒溫培養(yǎng)箱 銅柱除氧系統(tǒng) 定量加樣器 厭氧罐 超聲波破碎儀 酒精燈 冰塊 水浴鍋 記號(hào)筆 振蕩器 等

　　3.2 菌種的鑒定：

　　3.2.1 菌種：待測菌

　　3.2.2 培養(yǎng)基;糖發(fā)酵培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基(液體);

　　3.2.3 試劑;乙醚 吲哚試劑 盧戈氏碘液;

　　3.2.4 器材：超凈工作臺(tái) 恒溫培養(yǎng)箱 高壓蒸汽滅菌鍋 接種環(huán) 移液管載玻片 顯微鏡 等

　　四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟：

　　4.1分離與培養(yǎng)

　　4.1.1 銅柱系統(tǒng)除氧

　　銅柱是一個(gè)內(nèi)部裝有銅絲或銅屑的硬質(zhì)玻璃管。此管的大小為40～400mm，兩端被加工成漏斗狀，外壁繞有加熱帶，并與變壓器相連來控制電壓和穩(wěn)定銅柱的溫度。銅柱兩端連接膠管，一端連接氣鋼瓶，另一端連接出氣管口。由于從氣鋼瓶出來的氣體如N2、CO2 和H2等都含有微量O2，故當(dāng)這些氣體通過溫度約360℃的銅柱時(shí)，銅和氣體中的微量O2化合生成CuO，銅柱則由明亮的黃色變?yōu)楹谏�。�?dāng)向氧化狀的銅柱通入H2時(shí)，H2與CuO中的氧就結(jié)合形成H2O，而CuO又被還原成了銅，銅柱則又呈現(xiàn)明亮的黃色。此銅柱可以反復(fù)的使用，并不斷起到除氧的目的。當(dāng)然H2源也可以由氫氣發(fā)生器產(chǎn)生。

　　4.1.2 預(yù)還原培養(yǎng)基及稀釋液的制備

　　在無氧無菌的超凈厭氧手套箱中的條件下，制作預(yù)還原培養(yǎng)基及稀釋液時(shí)，先將配置好的培養(yǎng)基和稀釋液煮沸驅(qū)氧，而后用半定量加樣器趁熱分裝到螺口厭氧試管中，一般瓊脂培養(yǎng)基裝4.5～5.0mL，稀釋液裝9mL，并插入通N2氣的長針頭以排除O2。此時(shí)可以清楚的看到培養(yǎng)基內(nèi)加入的氧化還原指示劑—刃天青由藍(lán)到紅最后變成無色，說明試管內(nèi)已成為無氧狀態(tài)，然后蓋上螺口的丁烯膠塞及螺蓋，于滅氧罐中滅菌備用。

　　4.1.3 分離

　　(1)編號(hào)

　　取五支無菌水試管，分別用記號(hào)筆標(biāo)明10-1、10-2……10-5。

　　(2)稀釋

　　在無氧無菌的超凈厭氧手套箱中的條件下，用無菌注射器吸取1mL混合均勻的液體樣品，加入裝有預(yù)還原生理鹽水的厭氧試管中，用震蕩器將其混合均勻，制成10-1稀釋液。用無菌注射器吸取1mL10-1稀釋液至另一裝有9mL生理鹽水的厭氧試管中，制成10-2稀釋液。依此進(jìn)行10倍系列稀釋，至10-6，制成不同樣品稀釋液。通常選10-4、10-5、10-6三個(gè)稀釋度進(jìn)行滾管計(jì)數(shù)。

　　(3)滾管分離

　　1)滾管

　　將無氧無菌的瓊脂培養(yǎng)基在沸水浴中溶化，置46-50℃恒溫的水浴中，待用，當(dāng)培養(yǎng)基從瓶中取出時(shí)，要用N2在培養(yǎng)基內(nèi)中充氣。再在試管中用N2充氣，趕走所有管內(nèi)空氣，然后把培養(yǎng)基加入管內(nèi)，立即塞上瓶塞。待瓶塞塞入管內(nèi)，及時(shí)拔出充氣針頭。用無菌注射器吸取10-4、10-5、10-6三個(gè)稀釋度各0 .1mL，分別注入待用的試管中，然后將其平放于盛有冰水的瓷盤中迅速滾動(dòng)，帶菌的溶化瓊脂在試管內(nèi)壁會(huì)即刻形成凝固層。

　　2)分離純化

　　生成的菌落需挑取出來，鏡檢其形態(tài)及純度。如尚未獲得純培養(yǎng)物，需再次稀釋滾管，并再次挑取菌落，直至獲得純培養(yǎng)物為止。待挑取的單菌落預(yù)先在放大鏡下觀察確定，做好標(biāo)記。然后將培養(yǎng)基試管固定于適當(dāng)?shù)闹Ъ苌希�打開試管膠塞，同時(shí)迅速將氣流適當(dāng)、火焰滅過菌的氮?dú)忾L針頭插入管內(nèi)。同時(shí)，另一液體厭氧管去掉膠塞插入另一滅過菌的通氣針頭。將準(zhǔn)備好的彎頭毛細(xì)管小心插入固體培養(yǎng)基內(nèi)，找準(zhǔn)待挑菌落，輕輕吸取，轉(zhuǎn)移至液體試管內(nèi)，加塞。37℃培養(yǎng)，培養(yǎng)24h或更長時(shí)間或待培養(yǎng)液混濁后檢查已分離培養(yǎng)物的純度。

　　3)劃線分離

　　將試管橡皮塞的一端在火焰上灼燒一下，挨著打氣針塞住管口，在針頭快速取下前，通氣15-20s，管口一端在火焰上燒片刻。旋緊管塞，劃線后的卷管直立保溫，使用CO2:H2=80:20,因?yàn)镃O2比空氣重，開啟后管塞不致有空氣殘留。劃線后的滾管，置34-37度下培養(yǎng)，便可長出菌落。

　　4.1.4 鏡檢與計(jì)數(shù)

　　(1)鏡檢

　　挑取特征性菌落制片，革蘭氏染色后鏡檢，觀察菌體形態(tài)。

　　(2)計(jì)數(shù)

　　液體純培養(yǎng)物經(jīng)系列稀釋后，按上述滾管法培養(yǎng)。然后對(duì)固體滾管計(jì)數(shù)，計(jì)算每克或每毫升樣品中含有厭氧菌數(shù)量cfu/g(mL)樣品=A×10ml×X/10×D

　　A-0.1mL滾管計(jì)數(shù)的實(shí)際平均值;

　　X- 鏡檢呈現(xiàn)為厭氧菌的數(shù)目;

　　X/10-菌落中厭氧菌的概率;

　　D- 稀釋倍數(shù)

　　4.2 菌種的鑒定

　　4.2.1糖發(fā)酵試驗(yàn)

　　糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)是最常用的生化反應(yīng)，在腸道細(xì)菌鑒定上尤為重要。絕大多數(shù)細(xì)菌都能利用糖類作為碳源和能源，但是它們在分解糖的能力上有很大差異，有些細(xì)菌能分解糖并產(chǎn)酸(如乳酸、醋酸、丙酸等)和氣體(如氫、甲烷、二氧化碳等);有些細(xì)菌只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。例如大腸桿菌能分解乳糖和葡萄糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣;傷寒桿菌能分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不能分解乳糖;普通變形桿菌分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不能分解乳糖。酸的產(chǎn)生可以利用指示劑來斷定。在配制培養(yǎng)基時(shí)預(yù)先加入溴甲酚紫[pH5.2(黃色)—6.8(紫色)]，當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)酸時(shí)，可使培養(yǎng)基由紫色變?yōu)辄S色。氣體的產(chǎn)生可由發(fā)酵管中倒置的德漢氏小管中有無氣泡來證明。

　　具體實(shí)驗(yàn)步驟：

　�、� 將菌液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，之后在無菌環(huán)境下，取一定量的稀釋液注入生化鑒定管中，用無菌封口膜封口。

　�、� 將接種后的鑒定管放入?yún)捬豕拗�，充足氮�(dú)夂蠓湃?7℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

　�、� 24h后觀察各管中液體顏色變化及產(chǎn)氣情況。

　　4.2.2 蛋白質(zhì)分解實(shí)驗(yàn)

　�、� 將菌液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，之后在無菌環(huán)境下，取一定量的稀釋液注入生化鑒定管中，用無菌封口膜封口。

　　② 將接種后的鑒定管放入?yún)捬豕拗校�充足氮�(dú)夂蠓湃?7℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

　�、�24h后各管分別進(jìn)行米倫氏反應(yīng)、吲哚反應(yīng)、黃色反應(yīng)和坂口反應(yīng)等。

　　4.2.3 淀粉水解實(shí)驗(yàn)

　　① 將菌液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，之后在無菌環(huán)境下，取一定量的稀釋液注入生化鑒定管中，用無菌封口膜封口。

　�、� 將接種后的鑒定管放入?yún)捬豕拗�，充足氮�(dú)夂蠓湃?7℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

　�、� 24h后于各管中加入適量盧戈氏碘液觀察淀粉的水解情況。

　　五 注意事項(xiàng)及注釋：

　　1 注射器在使用前必須經(jīng)過121℃、20min滅菌。

　　2 注意無菌操作，保持手和培養(yǎng)管的清潔。每次接種前需用酒精棉球?qū)�厭氧管蓋子擦一遍。

　　3 用注射器吸取菌懸液注入固體培養(yǎng)基后，如需再次吸取，應(yīng)快速將注射器插入?yún)捬豕苤校�以防止針頭污染。

　　4樹脂刃天青(resazurin)既是還原劑又是指示劑，它可以把培養(yǎng)基中殘留的溶解氧去除，其氧化還原電位指示敏感范圍為-42mV。有氧時(shí)呈紫色或粉紅色，無氧時(shí)呈無色(培養(yǎng)基的顏色)，它是較為理想的氧化還原電位指示劑和培養(yǎng)嚴(yán)格厭氧菌不可缺少的。

　　5培養(yǎng)基中加入的青霉素是用來抑制其它細(xì)菌生長的，因?yàn)閰捬蹙�的�?xì)胞壁成分為假肽聚糖，不受青霉素影響。

　　6注射器在使用前必須先用培養(yǎng)基上面的氣體沖洗、填充，然后插入培養(yǎng)基的下層，以保證當(dāng)培養(yǎng)基移入試管時(shí)，就處于無氧氣體層的下面。